黃芪多糖對骨髓間充質干細胞向腫瘤相關成纖維細胞分化中IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路的影響

張艷輝 駱亞莉 劉永琦 王磊 許小敏 馮彩琴 李研

摘要：目的??觀察黃芪多糖（APS）在骨髓間充質干細胞（BMSCs）向腫瘤相關成纖維細胞（TAFs）分化中對IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路的影響，探討其可能的調控機制。方法??以白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導BMSCs，建立向TAFs方向分化的炎性微環境模型;采用CCK-8法分別檢測不同濃度IL-6/STAT3通路阻斷劑AG490和TNF-α/NF-κB通路阻斷劑BMS345541對BMSCs和誘導后BMSCs增殖能力的影響，Western blot檢測阻斷劑所對應的靶向蛋白JAK2和IKKβ的表達。將BMSCs分為空白組、模型組、模型+AG490組、模型+BMS345541組、模型+APS組，檢測各組TAFs標記分子α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、成纖維細胞活化蛋白（FAP）和IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路關鍵蛋白STAT3、p65的表達。結果??與空白組比較，模型組BMSCs增殖水平明顯增強（P<0.05）;10?μmol/L AG490和5?μmol/L BMS345541較模型組BMSCs抑制作用明顯增強（P<0.05）。10?μmol/L AG490對應的靶蛋白JAK2較其他各組表達減弱，5?μmol/L BMS345541對應的靶蛋白IKKβ較其他各組表達減弱，故選為最佳作用濃度。通路阻斷劑干預結果表明，與空白組比較，模型組TAFs標記分子α-SMA、FAP和通路關鍵蛋白STAT3、p65表達均明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，各干預組TAFs標記分子α-SMA、FAP和通路蛋白STAT3、p65表達均明顯下降（P<0.05）。結論??APS對IL-6、TNF-α誘導的BMSCs向TAFs方向分化有抑制作用，其機制可能與調控IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路有關。

關鍵詞：黃芪多糖;骨髓間充質干細胞;腫瘤相關成纖維細胞;IL-6/STAT3通路;TNF-α/NF-κB通路;通路阻斷劑

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.013

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2018）10-0054-06

Effects of Astragalus Polysaccharides on Pathways?of IL-6/STAT3 and TNF-α/NF-κB in Process of Differentiation from?BMSCs to TAFs

ZHANG Yan-hui， LUO Ya-li， LIU Yong-qi， WANG Lei， XU Xiao-min， FENG Cai-qin， LI Yan

Gansu University of Chinese Medicine， Provincial Key Laboratory of Major Disease Prevention and Control of Molecular Medicine and Traditional Chinese Medicine Research in Gansu Province， Key Laboratory of Dunhuang Medicine and Transformation at Provincial and Ministerial Level， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To observe the effects of Astragalus polysaccharides?（APS）?on pathways of IL-6/STAT3 and TNF-α/NF-κB in the process of differentiation from bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） to?tumor-associated fibroblasts （TAFs）; To discuss the possible regulatory mechanism. Methods BMSCs was induced by IL-6 and TNF-α， and an inflammatory microenvironment model which differentiated into TAFs direction was established. CCK-8 method was used to detect the effects of different concentrations of IL-6/STAT3 pathway blocker AG490 and TNF-α/NF-κB pathway blocker BMS345541 on BMSCs and its proliferation after induction. Target protein expressions of JAK2 and IKKβ?corresponding to blocker were detected by Western blot. BMSCs were divided into blank group， model group， model+AG490 group， model+BMS345541 group， and model+APS group; expressionsof α-SMA and FAP of TAFs marker molecules and the key proteins of STAT3 and p65 of IL-6/STAT3 and TNF-α/NF-κB pathway were detected. Results Compared with the blank group， the proliferation ability of the model group increased?significantly （P<0.05）; Compared with the model group， 10?μmol/L AG490 and 5?μmol/L BMS345541 had a strong inhibitory effect on the proliferation ability （P<0.05）. The expression of JAK2， a target protein corresponding to 10?μmol/L AG490， was weaker than that of other groups. The target protein IKKβ?corresponding to 5?μmol/L BMS345541 was weaker than the other groups， so it was selected as the best concentration. The results of pathway intervening blockers showed that compared with the blank group， the expressions of TAFs makers α-SMA and FAP， and key proteins STAT3 and p65 of pathway in the model group increased significantly （P<0.05）; Compared with model group， the expressions of TAFs makers α-SMA and FAP， and key proteins STAT3 and p65 of pathway in other groups decreased significantly （P<0.05）. Conclusion APS?has inhibitory effects on the differentiation of BMSCs into TAFs induced by IL-6 and TNF-α， and its mechanism may be related to the regulation of pathways of IL-6/STAT3 and TNF-α/NF-κB.

Keywords：Astragalus polysaccharides; bone marrow mesenchymal stem cells; tumor-associated fibroblasts; IL-6/STAT3 pathway; TNF-α/NF-κB pathway; pathway blocker

近年來我國惡性腫瘤發病率和死亡率呈上升趨勢^[1]，因此對腫瘤的防治刻不容緩。骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）具有低免疫原性、多向分化的潛能，有抗腫瘤作用。有研究顯示，干細胞微環境異常可使BMSCs發生遺傳穩定性的變化甚至分化為腫瘤相關成纖維細胞（tumor-?associated fibroblasts，TAFs）^[2-3]。在這一過程中，白細胞介素-6（IL-6）介導的STAT3通路^[4]和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）介導的核因子-κB（NF-κB）^[5]通路可能扮演重要的角色。因此，阻斷與TAFs相關的因子或信號通路^[6]有望成為應用BMSCs靶向治療腫瘤的新方式。黃芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS）是黃芪的主要成分之一。本課題組前期研究表明，APS可抑制肺癌微環境中BMSCs增殖的異常改變和維護其所處微環境及自身的穩定^[7]。本實驗通過阻斷與異常分化密切相關的通路，探討APS對炎性微環境中BMSCs向TAFs方向分化的可能調控機制。

1 ?實驗材料

1.1 ?藥物、細胞和培養

APS（批號ZD1219LA13），上海源葉生物;BMSCs細胞株（編號7500），美國ScienCell公司。將BMSCs用MSCM培養基培養于5%CO₂、37 ℃的恒溫培養箱中，每2～3 d換液1次。待細胞融合度達80%后，0.25%胰蛋白酶消化傳代，第3代細胞用于實驗。

1.2 ?主要試劑與儀器

0.25%胰蛋白酶（批號J170024），Hyclone公司; CCK-8試劑盒（批號170832），上海尚寶生物科技有限公司;人IL-6（批號031316 D1315），PEPRO TECH公司;人TNF-α（批號0607B25 G2516），PEPRO TECH公司;AG490（批號18826），MCE公司;BMS345541（批號8419），MCE公司;兔抗人IKK-β多克隆抗體（批號GR322133-5），Abcam公司;兔抗人JAK2多克隆抗體（批號GR312865-2），Abcam公司;兔抗人GAPDH多克隆抗體（批號AB-P-R001），杭州賢至生物公司;兔抗人α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）多克隆抗體（批號42046），GeneTex公司;兔抗人成纖維細胞活化蛋白（FAP）多克隆抗體（批號YT0845），ImmunoWay公司;兔抗人STAT3多克隆抗體（批號39953），GeneTex公司;兔抗人p65多克隆抗體（批號41556），GeneTex公司;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（批號B0201），ImmunoWay公司。CO₂培養箱（型號MCO-18AIC），日本三洋電機公司;Countstar自動細胞計數儀（型號IC1000），上海睿鈺生物科技有限公司;酶標儀（型號IMARK），美國BIO-RAD公司;倒置相差顯微鏡（型號IX81），日本OLYMPUS公司;凝膠成像分析系統（型號Chemi Doc），美國BIO-RAD公司。

2 ?實驗方法

2.1 ?分組

將BMSCs分為空白組、模型組、模型+AG490組、模型+BMS345541組、模型+APS組。取第3代狀態良好的BMSCs，將細胞濃度調整為1×10⁴個/mL的單細胞懸液，每孔2 mL接種于6孔板內。除空白組外，分別以IL-6 100 ng/mL和TNF-α 50?ng/mL進行干預。每3?d換液1次，每次換液補充新的IL-6和TNF-α，每7?d傳代1次，連續誘導42?d后作為模型組細胞用于后續實驗。各組細胞倒置相差顯微鏡鏡下觀測并采集細胞生長狀況。

2.2 ?CCK-8法檢測骨髓間充質干細胞增殖

將融合度約為85%的BMSCs用0.25%胰酶消化后吹打成單細胞懸液，以2×10³/孔接種于5個96孔板，置于細胞培養箱中培養，細胞貼壁后加入不同濃度（10、5、2.5 μmol/L）的AG490和BMS345541，每個濃度設4個復孔，分別于24、48、72、96、120 h后每孔加10 μL CCK-8試劑，于酶標儀波長450?nm處檢測各組細胞OD值。

2.3 ?Western blot檢測阻斷劑靶向蛋白JAK2、IKKβ和成纖維細胞標記分子α-平滑肌肌動蛋白、成纖維細胞活化蛋白及通路蛋白STAT3、p65表達水平

提取各組細胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。各組取10?μL蛋白上樣，經5%、12%凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，置于4?℃冰箱與相應的一抗（1∶1000）相結合，搖床過夜;次日與辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（1∶4000）結合反應，ECL發光顯色后，凝膠成像系統曝光檢測，采用ImageJ軟件對圖像進行灰度分析。以GAPDH作內參照，計算各組蛋白的相對表達量。

3 ?統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行分析。實驗數據以x（—）±s表示。組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 ?結果

4.1??不同濃度阻斷劑AG490和BMS345541對骨髓間充質干細胞增殖的影響

與空白組比較，不同濃度AG490對BMSCs增殖無明顯影響（P>0.05），5、2.5?μmol/L?BMS345541對BMSCs增殖無明顯影響（P>0.05），而10?μmol/L?BMS345541干預后BMSCs的OD值明顯下降（P<0.05）。見圖1。

與空白組比較，模型組BMSCs增殖水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，10?μmol/L?AG490和5?μmol/L?BMS345541可使BMSCs增殖水平明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。因此，選擇10?μmol/L?AG490和5?μmol/L?BMS345541為用于本實驗的最佳作用濃度。

4.2??不同濃度阻斷劑對骨髓間充質干細胞靶向蛋白JAK2和IKKβ表達的影響

與空白組比較，模型組BMSCs?JAK2和IKKβ表達顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，不同濃度阻斷劑干預后JAK2和IKKβ蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），且與其濃度呈負相關。結果見圖3～圖5。

4.3 ?細胞形態變化

通路阻斷劑干預后，空白組BMSCs細胞為梭形，排列整齊，呈旋渦狀生長;模型組BMSCs細胞排列紊亂、成團簇狀生長;M+A組、M+B組和M+APS組細胞成纖維樣，排列分布較均勻。見圖6。

4.4 ?不同濃度阻斷劑對腫瘤相關成纖維細胞標記分子α-平滑肌肌動蛋白、成纖維細胞活化蛋白表達的影響

通路阻斷劑干預后，與空白組比較，模型組BMSCs TAFs標記分子α-SMA和FAP蛋白表達明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，通路阻斷劑AG490、BMS345541及APS干預后，BMSCs?α-SMA和FAP蛋白表達明顯降低（P<0.05）。見圖7～圖9。

4.5 ?不同濃度阻斷劑對骨髓間充質干細胞通路關鍵蛋白STAT3和p65表達的影響

與空白組比較，模型組BMSCs IL-6/STAT3通路關鍵蛋白STAT3和TNF-α/NF-κB通路關鍵蛋白p65表達明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，通路阻斷劑AG490、BMS345541及APS干預后，BMSCs IL-6/STAT3通路關鍵蛋白STAT3和TNF-α/NF-κB通路關鍵蛋白p65表達明顯降低（P<0.05）。見圖10～圖12。

5 ?討論

基于具有多向分化性及低免疫源性等優點，BMSCs作為治療腫瘤的生物靶向載體已成為研究熱點，但在異常微環境中，BMSCs具有惡性轉化的風險，具體機制尚不明^[8]。本課題組前期實驗顯示，干細胞生存的微環境及信號通路的改變可誘導BMSCs向TAFs分化^[9]，這提示BMSCs在一定的炎性或腫瘤微環境中難以保全其自身的穩定，可能具有了促瘤或致瘤性^[10]。腫瘤間質中活化的成纖維細胞被稱作TAFs，又稱癌相關成纖維細胞，是腫瘤微環境的重要組成部分，而BMSCs是TAFs的主要來源之一^[11-13]，因此在炎性或腫瘤微環境中，阻斷BMSCs向TAFs方向分化的路徑是維護BMSCs自身穩定性的有效手段，也可能是BMSCs作為靶向載體發揮治療腫瘤作用的關鍵點之所在。劉永琦等^[14]基于中醫學“腎藏精，主骨生髓”理論，認為構成生命原始物質的“先天之精”具有繁衍生殖、生髓化血、化氣化神等多元化生性，與BMSCs多向分化的能力具有對應性，故認為干細胞具有先天之精屬性，是先天之精在細胞層次的存在形式，BMSCs的分布與“元氣”分布也相似^[15]。元精、元氣皆根于腎，元精在元氣推動下，不斷濡養形體、臟腑、氣血，使五液充，五氣治，形體健，營衛調，十二臟化源充足，BMSCs才能維持其自身的穩定性。而在精傷氣耗所致腫瘤微環境中，精無所化而失潤，氣不衛外而失固，十二臟生化無源，導致機體陰陽失衡，進而使細胞信息傳導失司，最終BMSCs因內外陰陽的失衡而發生惡性轉變。黃芪作為益氣之品，其性溫可助陽扶正以御外邪，其味甘可培補中氣使驅邪之力生化有源，其歸經肺脾可益氣固表達“陰之使也”守護之功，諸用共奏平衡內外陰陽之效。APS為黃芪的主要成分之一，有調節免疫、抗腫瘤、抗炎、抗病毒及抗氧化等藥理作用^[16]。

有研究表明，抑制IL-6/STAT3信號通路可減少TAFs介導的細胞增殖^[17]。當NF-κB通路處于抑制狀態時，TAFs支持腫瘤促血管生成、癌細胞增殖、侵襲等作用被減弱^[18]。IKKβ亞基是調節NF-κB活性的主要上游靶點，而BMS345541是IKKβ的高選擇性抑制劑。本實驗結果顯示，10?μmol/L AG490、5?μmol/L BMS345541不僅能發揮明顯的阻斷作用并對BMSCs的增殖影響最小，且對各自所對應靶蛋白抑制作用最明顯。通路阻斷劑干預后，兩通路中關鍵蛋白STAT3、p65表達均下降，TAFs標記分子α-SMA、FAP蛋白表達也明顯減少。提示BMCSs向TAFs方向的分化與IL-6介導的STAT3通路和TNF-α介導的NF-κB通路有關，并且APS對異常微環境中的BMSCs發揮保護作用可能是通過調控IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路來實現的。

本實驗是用IL-6和TNF-α模擬炎性細胞微環境，主要從IL-6和TNF-α介導的經典通路分析BMSCs炎性微環境異常分化機制。但炎性微環境極其復雜，對BMSCs的調控可能涉及多條通路、多種因子等的綜合作用。APS發揮作用的具體物質基礎尚不明確，有待深入研究和探索。

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