基于信息熵理論正交試驗優選荊防小兒口服液提取工藝
2018-12-20 01:42:08唐林彭穎雷昌喬勇朱坤夏新華
中國中醫藥信息雜志 2018年10期
唐林 彭穎 雷昌 喬勇 朱坤 夏新華
摘要：目的??優選荊防小兒口服液的最佳提取工藝。方法??以苦杏仁苷轉移率、升麻素苷轉移率、5-O-甲基維斯阿米醇苷轉移率、浸膏得率為評價指標，采用正交試驗設計及信息熵理論考察加水量、提取時間對提取工藝的影響。結果??荊防小兒口服液的最佳提取工藝條件為：加水量為10倍量，提取時間為1.0 h，回流提取2次。結論??本研究優選出的提取工藝簡單、穩定，可為荊防小兒口服液的工業化生產提供依據。
關鍵詞：荊防小兒口服液;正交試驗;提取工藝;信息熵
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.020
中圖分類號：R283.5 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2018）10-0091-05
Optimization of Extraction Process of Jingfang?Children Oral Liquid?with Orthogonal TestBased on Information Entropy Theory
TANG Lin1， PENG Ying2， LEI Chang2， QIAO Yong2， ZHU Kun2， XIA Xin-hua2
1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China; 2. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China
Abstract： Objective?To optimize the extraction process of Jingfang?Children Oral Liquid. Methods?Orthogonal test design and information entropy theory were?used to study the influence of water volume and extraction time on extraction process with transferring rates of amygdalin， prim-O-glucosylcimifugin?and?5-O-methylvisammioside， and extract yield as evaluation indexes. Results?The optimal?extraction process conditions were as follows： the ratio of water volume to raw materials weight was 10：1， extraction time was 1.0 h and extracted twice?under reflux. Conclusion?The optimal?extraction process is simple and stable， which can provide references for industrial production of Jingfang Children Oral Liquid.
Keywords：?Jingfang Children Oral Liquid; orthogonal test; extraction process; information entropy
荊防小兒口服液由荊芥、防風、苦杏仁、生石膏等12味中藥組方制備而成，具有清熱解表、止咳化痰的功效，為湖南中醫藥大學第一附屬醫院張滌教授經驗方，臨床用于治療小兒急性支氣管炎和小兒慢性支氣管炎的急性發作。防風為方中君藥，色原酮類化合物升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷是其指標成分，具有明顯的解熱、抗炎、鎮痛作用[1]。苦杏仁為方中臣藥，能降肺氣之上逆，可宣肺氣之郁滯，為止咳平喘之要藥，現代研究表明，其指標成分苦杏仁苷具有抗炎、抗潰瘍、抗肺纖維化等藥理活性[2]，可起到鎮咳平喘作用[3]。由于升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷等成分均易溶于水[4]，同時考慮到水煎的傳統提取方法，確定了本制劑的水提工藝。為進一步確定該制劑合理的生產工藝，保證其臨床療效，本試驗以升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和苦杏仁苷的提取轉移率及浸膏得率為指標綜合評分，采用正交試驗法及信息熵理論對提取工藝進行優選，篩選該方的最佳提取工藝參數，為該制劑的中試放大及產業化生產提供數據支持。
1 ?儀器與試藥
1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司;Hei-Vap Advantage（ML）型旋轉蒸發儀，德國Heidolph;AL-204型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;SK-7200HP超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司;SXKW數顯控溫電熱套，北京市永光明醫療儀器廠;Purelab Option Q15超純水機（法國威立雅ELGA）。
飲片均購自康美藥業股份有限公司，符合2015年版《中華人民共和國藥典》各藥項下規定。對照品苦杏仁苷（批號110820-201506，純度93.4%）、升麻素苷（批號111522-201511，純度94.8%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號111523-201509，純度95.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。
2 ?方法與結果
2.1 ?浸膏得率測定
精密量取水提樣品藥液25 mL（V1），置已干燥至恒重的蒸發皿（M1）中，水浴蒸干，于105 ℃干燥5 h，取出，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量（M2），計算樣品的浸膏得率。浸膏得率=（M2-M1）V2/m總V1。式中，m總為水提藥液中藥材總質量，V2為水提藥液總體積。
2.2 ?指標成分測定
2.2.1 ?苦杏仁苷含量測定
2.2.1.1 ?色譜條件
采用Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（20∶80），檢測波長210 nm，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，記錄時間25 min。
2.2.1.2 ?對照品溶液的制備
精密稱取苦杏仁苷對照品9.8 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為183.06 μg/mL的苦杏仁苷對照品溶液，于冰箱中冷藏備用。
2.2.1.3 ?供試品溶液的制備
精密量取水提樣品藥液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，備用。
2.2.1.4 ?陰性對照溶液的制備
按處方比例稱取除苦杏仁外的其余飲片，加水提取2次，濃縮定容。精密量取濃縮液2 mL，按上述供試品溶液制備方法制備，即得。
2.2.2 ?升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量測定
2.2.2.1 ?色譜條件
采用Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～15 min，12%A;15～40 min，12%～28%A），檢測波長254 nm，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，記錄時間40 min。
2.2.2.2 ?對照品貯備液的制備
分別精密稱取升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品14.5、15.4 mg，分別置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，于冰箱中冷藏備用。
2.2.2.3 ?混合對照品溶液的制備
分別精密量取升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品貯備液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度分別為27.49、29.51 μg/mL的混合對照品溶液。
2.2.2.4 ?供試品溶液的制備
精密量取水提藥液2 mL置離心管中，加入8 mL甲醇，充分搖勻，離心后取上清液于旋轉蒸發儀上濃縮至干（60 ℃），殘渣加甲醇使溶解，加至中性氧化鋁柱（100?200目，4 g，內徑1 cm）上，用50%乙醇20 mL洗脫，收集洗脫液，于旋轉蒸發儀上濃縮至干（60 ℃），殘渣用甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，備用。
2.2.2.5 ?陰性對照溶液的制備
按處方比例稱取除防風外的其余飲片，加水提取2次，濃縮定容。精密量取濃縮液2 mL，按上述供試品溶液制備方法制備，即得。
2.2.3 ?方法學考察
2.2.3.1 ?專屬性試驗
分別精密吸取“2.2.1”項下苦杏仁苷對照品溶液、供試品溶液、苦杏仁陰性對照溶液，及“2.2.2”項下升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷混合對照品溶液、供試品溶液、防風陰性對照溶液，各10 μL，按上述相應的色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。結果表明供試品色譜中苦杏仁苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷與其他成分均分離良好（R>1.5），且陰性對照無干擾。
2.2.3.2 ?線性關系考察
分別精密量取苦杏仁苷對照品溶液（282.07 μg/mL）及升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷混合對照品溶液（各取對照品貯備液5 mL，加甲醇定容至25 mL）1、2、4、6、8、10 μL，按上述相應的色譜條件進樣，測定峰面積積分值。以峰面積積分值為縱坐標，對照品進樣量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程，結果見表1。
2.2.3.3 ?精密度試驗
分別精密量取苦杏仁苷對照品溶液及升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品溶液各10 μL、按上述色譜條件連續進樣6次，測量記錄其峰面積，結果苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的RSD分別為2.07%、2.02%、0.95%，表明儀器精密性良好。
2.2.3.4 ?穩定性試驗
分別取同一供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h注入液相色譜儀，按上述色譜條件進樣檢測，記錄峰面積積分值，結果苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的RSD分別為1.16%、1.73%、1.69%，表明供試品溶液在24 h內穩定性。
2.2.3.5 ?重復性試驗
精密量取水提藥液2 mL，共12份，等分為2組，分別按“2.2.1.3”與“2.2.2.4”項下方法各制備6份供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定并計算。結果樣品中苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷RSD分別為2.73%、2.84%、2.80%，表明本法重復性好。
2.2.3.6 ?加樣回收率試驗
精密量取水提藥液1 mL，共6份，分別精密加入苦杏仁苷對照品溶液（612.70 μg/mL）1 mL;另精密量取水提藥液1 mL，共6份，分別精密加入升麻素苷對照品溶液（40.57 μg/mL）2 mL與5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品溶液（41.39 μg/mL）1 mL。分別按上述色譜條件測定苦杏仁苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，計算得苦杏仁苷的平均回收率與RSD分別為99.20%、2.65%，升麻素苷的平均回收率與RSD分別為100.74%、2.61%，5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均回收率與RSD分別為99.77%、1.98%，表明本法測定的準確度高。
2.3 ?正交試驗優選水提工藝
本制劑處方由12味中藥組成，經處方分析，確定對方中防風等3味藥先采用蒸餾法提取揮發油[5-6]，其藥渣再與苦杏仁等9味混合用水煎提。前期已對揮發油提取工藝進行優化，本試驗基于相關文獻[7]及預試驗結果，選取加水量（A）、提取時間（B）為考察因素，采用正交設計對水提工藝進行研究。
2.3.1 ?正交試驗設計
按處方比例稱取飲片216 g，共9份，先采用蒸餾法提取防風等3味藥的揮發油，其藥渣與苦杏仁等9味混合（其中苦杏仁于水沸后加入），用L9（34）正交表安排試驗，加水回流提取2次，收集2次提取液并與提油后的藥渣濾液合并，濃縮定容至500 mL。分別按上述色譜條件測定并計算苦杏仁苷、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的提取轉移率及浸膏得率。
2.3.2 ?水提工藝數據處理及分析
采用熵權法及專家咨詢法對評價指標進行權重系數分配，計算綜合評分。提取工藝評價指標多分為浸膏得率與有效成分轉移率兩類，其中有效成分轉移率為主要評價指標，而浸膏得率常作為參考指標，本試驗對有效成分轉移率與浸膏得率分別評定權重系數。采用專家建議將浸膏得率的權重系數定為0.1，有效成分轉移率的總權重系數定為0.9。
根據文獻方法[7-8]將有效成分建立原始評價指標矩陣（X），將原始矩陣轉換為概率矩陣（P），計算各項指標（苦杏仁苷轉移率、升麻素苷轉移率和5-O-甲基維斯阿米醇苷轉移率）的信息熵（Hi），計算第i項指標的系數（Wi）。
有效成分轉移率總權重系數為0.9，則修正后第i項指標的系數（Wi*）=Wi×0.9=[0.738?8??0.107?8 ?0.053 4]。
對于1個m行n列的概率矩陣，綜合評價指標Mm=P1mW1+P2mW2+P3mW3+…+PnmWn，即苦杏仁苷轉移率、升麻素苷轉移率、5-O-甲基維斯阿米醇苷轉移率及浸膏得率的權重系數依次為0.74、0.11、0.05、0.10。
對概率矩陣數據進行加權處理，得到綜合評分。綜合評分=苦杏仁苷轉移率÷苦杏仁苷轉移率max×0.74+升麻素苷轉移率÷升麻素苷轉移率max×0.11+5-O-甲基維斯阿米醇苷轉移率÷5-O-甲基維斯阿米醇苷轉移率max×0.05+浸膏得率÷浸膏得率max×0.1。
正交試驗結果見表2，方差分析見表3。
由直觀分析可以看出，A因素各水平的K值依次為K3>K2>K1、B因素各水平的K值依次為K3≈K2>K1，對總的提取效果的影響為B>A;方差分析顯示，A、B兩因素的影響均有顯著性。綜合上述分析，從縮短生產時間和減少能耗等角度考慮，由于B2與B3的K值差別很小，可選B2。因此，確定最優提取工藝方案為A3B2，即加10倍量水，提取1.0 h。
2.3.3 ?驗證試驗
參照“2.3.1”項下提取工藝，按上述優選的最佳工藝方案A3B2，平行試驗3次，結果見表4。該方案與正交試驗表中相同試驗方案（即綜合評分最高的8號試驗）結果相近，苦杏仁苷轉移率、升麻素苷轉移率、5-O-甲基維斯阿米醇苷轉移率、浸膏得率RSD分別為1.00%、1.05%、0.92%、2.77%，說明該工藝條件合理可行，結果穩定可靠。
2.3.4 ?提取次數考察
在上述正交驗證試驗水提2次完成后，向藥渣中加入10倍量水，提取1.0 h，濃縮定容至500 mL，即得第3次提取液。按上述方法分別測定苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的提取轉移率及浸膏得率。結果表明，第3次提取液中苦杏仁苷轉移率、浸膏得率分別為6.28%、2.22%，升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷的轉移率幾乎為0。4個指標所占3次提取率的比率均小于10%，故從降低生產成本角度考慮，以提取2次為宜。
3 ?討論
本試驗曾考慮將升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和苦杏仁苷用同一HPLC條件進行檢測，但發現苦杏仁苷與升麻素苷的色譜峰存在陰性干擾，故參照藥典及文獻方法[9-11]在2種不同的HPLC條件下分別對上述3種成分進行測定。測定苦杏仁苷時，發現流速與柱溫對其分離影響不大，而采用適宜的色譜柱并調節流動相的比例可顯著改善苦杏仁苷的分離效果，且陰性對照無干擾。測定升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷時，采用中性氧化鋁柱對水提藥液進行純化，可消除雜質對測定的干擾。
本試驗前期曾對苦杏仁進行了冷水加熱提取與沸水直接提取的比較。結果表明，苦杏仁于水沸后加入能顯著增加苦杏仁苷的轉移率[12]，可能是“殺酶保苷”的效果。
采用正交設計優選中藥制劑提取工藝時，常涉及“提取次數”的問題。文獻報道常將其作為“正交試驗”的考察因素，筆者認為這樣不妥。因為正交設計要求各因素之間必須獨立，否則將影響其他因素的分析結果[13]。而提取次數為非獨立變量，其變化同時伴隨總的提取溶劑用量與提取時間的變化，其改變對提取效果的影響主要由總的提取溶劑用量與提取時間發生較大改變所致，因而對正交試驗結果進行方差分析，“提取次數”通常表現為具有顯著影響，其他因素的影響則不顯著[14-15]，故將“提取次數”納入正交試驗設計進行考察，會掩蓋其他提取工藝因素的顯著性分析結果，進而影響提取工藝優化結果的可靠性。因此，正交試驗設計時應避免將“提取次數”納入考察因素的選擇。
本試驗選擇方中多個活性成分的轉移率和浸膏得率作為提取工藝的評價指標，符合中藥復方多成分多靶點起效的特點。各指標間的客觀賦權一直困擾著中藥提取工藝的綜合評價。傳統的評價方法多采用專家咨詢法，具有一定的主觀性[16]，信息熵理論基于對試驗數據的充分分析，減少了主觀因素對試驗結果的干擾[17]，但往往忽略了中藥提取工藝的實際情況，如浸膏得率常作為中藥提取工藝的評價指標，但一般不作為主要評價指標，故本試驗將專家咨詢法與信息熵理論相結合應用于多指標的綜合分析，提升了本試驗研究的嚴謹性及合理性。另外，將提取次數置于驗證試驗中進行考察，可避免其對正交試驗結果的干擾，既保證了提取工藝考察數據的科學性，又可保證其完整性。優化后的提取工藝結果穩定可靠，可為該處方的工業化生產及進一步開發提供重要依據，同時也可為今后中藥提取工藝正交試驗設計的因素選擇提供參考。
參考文獻：
[1] 牛德斌.HPLC測定防風通圣丸中2個色原酮苷類成分含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（16）：113-115.
[2] 呂建珍，鄧家剛.苦杏仁苷的藥理作用研究進展[J].現代藥物與臨床， 2012，27（5）：530-535.
[3] 謝穎.麻黃-杏仁藥對配伍的主要化學成分及尿液代謝物的研究[D].廣州：南方醫科大學，2013.
[4] 王仁杰，周恩麗，李淼，等.多指標正交試驗法優選小續命湯水提工藝[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2016，18（4）：659-663.
[5] 葛衛紅，沈映君.荊芥、防風揮發油抗炎作用的實驗研究[J].成都中醫藥大學學報，2003，26（1）：55-57.
[6] 郭際.連翹揮發油抗炎作用及機理研究[D].成都：成都中醫藥大學， 2005.
[7] 吳璐，楊華生.基于信息熵理論的中藥提取工藝優選[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（9）：29-31.
[8] 王仁杰，李淼，閆明，等.信息熵理論在熱毒寧口服制劑中金銀花與梔子提取工藝優選中的應用[J].中草藥，2015，46（5）：683-687.
[9] 白海波，南志成，宋子榮.杏仁提取條件的探討[J].中國現代應用藥學，?2002，19（6）：476-477.
[10] 周斌，高文遠，張鐵軍，等.苦杏仁配方顆粒制備工藝和質量標準研究[J].中國實驗方劑學雜志，2006，12（11）：1-3.
[11] 黃月純，尹雪，魏剛.玉屏風方飲片及湯劑中毛蕊異黃酮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量相關性研究[J].中國實驗方劑學雜志， 2008，14（6）：6-9.
[12] 王彬輝，章文紅，張曉芬，等.苦杏仁苷提取工藝及藥理作用研究新進展[J].中華中醫藥學刊，2014，32（2）：381-384.
[13] 石磊，項可風.非正交試驗的平方和分解及其應用[J].系統科學與數學，1992，12（4）：356-370.
[14] 劉效栓，畢映燕，李季文，等.多指標優選健胃清腸口服液提取工藝研究[J].中成藥，2014，36（11）：2427-2429.
[15] 楊勇，吳敏，王初.正交試驗優選十全大補膏的提取工藝研究[J].中草藥，2010，41（1）：71-72.
[16] 李勇，何偉.正交試驗優選痛風膠囊提取工藝[J].中國新藥雜志， 2012，21（12）：1418-1421.
[17] 李淼，王星星，康小東，等.基于信息熵理論的哮喘方水提取工藝優選研究[J].中草藥，2016，47（12）：2113-2117.
