響應面法優化雞胸肉蛋白酶解工藝

安攀宇，趙 珊，張 淼，李燮昕，李 維，王 鑫

（四川旅游學院食品學院，四川 成都 610100）

雞肉作為人類的日常食物，具有較高的蛋白質含量，同時由于其低脂肪和低膽固醇含量受到人們的普遍青睞，也被稱為營養之源。在居民的食譜中，雞肉僅次于豬肉，成為人類消費的第二大肉類產品，雞肉滋味鮮美，適合多種烹調方法[1]。近年來，隨著經濟的發展，居民消費水平不斷提升，肉類食品消費量逐漸遞增，僅2000—2016年，世界范圍內人類整體的雞肉產量增長4.07%，消費量平均增長4.27%。其中，在全球不同地區和國家的分布上，主要集中在美國、巴西和中國，這幾個國家的雞肉消費量占全球的比例分別為20.60%、14.60%和13.90%，中國每年人均消費量為10 kg，美國42 kg，巴西48 kg[2]。與美國和巴西相比，我國人均雞肉消費水平較低，未來增長空間較大。利用現代食品加工技術對雞胴體中最大的分割產品雞胸肉進行深加工既是提高其資源利用率和附加值的有效途徑，也能豐富雞肉終端產品種類，利用科技手段增強食品行業的科技含量，有利于我國食品企業增強自身的競爭水平和行業抗風險能力[3-4]。

水解動物蛋白富含氨基酸，營養成分相對較高，具有水溶性好的特點，可以改善食物的風味，使其更好地融入動物的自然味道。水解動物蛋白作為新型的食品添加劑，可廣泛應用于復合調味品和營養強化食品加工中[5]。因此，大量的水解動物蛋白成分被廣泛應用到食品加工生產領域，尤其是保健食品和復合調味品領域。目前，動物水解蛋白主要基于酶法水解獲取，在水解過程中可以保留原有的鮮味，富含活性肽。Shahidi[6]的研究也顯示，在動物的水解蛋白中含有大量的游離氨基酸。動物水解蛋白中，氯丙醇等對人體有害的成分幾乎不存在，因此具有很好的市場前景。前人研究多集中在使用正交試驗對蛋白酶進行分步水解[7]，或將蛋白酶進行簡單復配來對雞肉進行酶解[8]。對于如何從眾多蛋白酶中選擇合適的酶來水解雞胸肉，且如何將多酶進行復配，均未進行深入探討。另外，多數研究對于水解液的感官指標并未進行分析或將各項感官得分匯總分析，并未集中研究作為熱反應前體物質的水解液在感官指標上應具備哪些突出特點[9]。本研究通過采集家養雞雞胸肉作為研究標本，在實驗設計上采用單因素試驗和響應面試驗方法，通過對感官指標和水解度的分析，對蛋白水解酶種類和復配蛋白酶酶解條件的選擇進行研究，通過改進試驗方法獲取更為優質的酶解液，并將其作為熱反應的前體物質，從而為雞肉蛋白水解物的推廣使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍雞胸肉，市售，購自永輝超市。

復合蛋白酶（70 000 U/g）、風味蛋白酶（500 LAPU/g）、肉類水解專用酶（3 5 0 0 0 U/g）、中性蛋白酶（1 600 AU/g）、木瓜蛋白酶（90 000 U/g）、胰蛋白酶（40 000 U/g） 河南圣斯德實業有限公司；甲醛（含量37%～40%） 成都金山化學試劑有限公司；氫氧化鈉（含量≥96%） 天津鼎盛鑫化工有限公司；pH緩沖劑 上海雷磁-創益儀器儀表有限公司。

1.2 儀器與設備

H2050R臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器有限公司；ST2100 pH計 奧豪斯儀器（常州）有限公司；85-1磁力攪拌器 江蘇省金壇市醫療儀器廠；DS-1高速組織粉碎機 上海標本模型廠；YP-N電子天平 上海精密儀器儀表有限公司；835-50氨基酸分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 雞胸肉酶解液的制備

雞胸肉去除結締組織和脂肪→洗凈→切成顆粒狀→勻漿→按比例加入蒸餾水→加酶恒溫酶解（水浴）→滅酶（100 ℃，10 min）→離心（7 000 r/min，4 ℃，15 min）→取上清液[10]

1.3.2 水解度測定

采用固定的方法，通過外部條件的控制，可以使蛋白質肽鍵水解斷裂，水解后斷裂的肽鍵數與總數的比為水解度。通常根據行業相關的測定方法采用水解后釋放的氨基酸數進行測定[11-12]。水解度按照下式計算。

其中，通過凱氏定氮法對總蛋白氮含量進行測定[13]；采用甲醛滴定法對游離氨基酸含量進行測定[14]。

1.3.3 氨基酸組成分析

采用Hitachi 835-50型氨基酸分析儀進行氨基酸成分測定。

1.3.4 感官評定

經過專門培訓的人員組成感官評定小組，共計8 名成員，年齡20～30 歲。樣品的鹽含量為0.50%，待測時的溫度為（25±1） ℃。在篩選過程中，對6 種酶解液進行評價，對不同的味道指標，如甜味、酸味等，基于感官評分法[15]進行評價。

在感官評定中設置對照組[16]，對照組為2 g/100 mL麥芽糊精溶液。

在評定標準的選取上，采取1～7 分的不同檔次，其中1 分為非常弱，7 分為很強，中間依次為很弱、對照組、一般、稍強、比較強。感官評定結果取8 人評定結果的平均值。

1.3.5 單因素試驗設計

1.3.5.1 蛋白酶種類的篩選

在選定雞胸肉標本后，采用6 種不同蛋白酶對其進行水解，分別為復合蛋白酶、風味蛋白酶、肉類水解專用酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶。不同的酶在酶解過程中具有不同的特點，而與不同底物進行反應也會產生不同的特征[17-19]。基于預實驗獲取的實驗數據和參數，綜合考慮相關的因素，選取統一的酶解基礎工藝[20-22]，如表1所示。通過對水解度和感官評分的分析，篩選出2 種水解效果較好的單酶進行下一步的復配。

表1 雞胸肉酶解基礎工藝Table 1 Initial enzymatic hydrolysis conditions of chicken breast proteins

1.3.5.2 木瓜蛋白酶、復合蛋白酶復配比例的選擇

在單因素試驗基礎上，選取水解度作為評價指標，研究木瓜蛋白酶和復合蛋白酶2 種單酶的水解效果以及二者復配后的水解效果，每組實驗重復3 次。

1.3.5.3 復配蛋白酶酶解條件的選擇

將復合蛋白酶與木瓜蛋白酶進行復配（復配比例2∶1），選取水解度作為評價指標，分別研究不同的復配比例、復配蛋白酶添加量、酶解時間、反應溫度以及固液比對雞胸肉水解效果的影響，每組實驗重復3 次。

1.3.6 復配蛋白酶酶解條件優化的響應面試驗設計

選擇復配蛋白酶復配比例（復合蛋白酶∶木瓜蛋白酶）、復配蛋白酶添加量、酶解溫度以及固液比（雞胸肉泥∶蒸餾水）4 個因素，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken法進行4因素3水平的響應面試驗，以水解度為響應值。相應的因素水平如表2所示，進行3 次重復試驗。

表2 響應面試驗設計因素與水平Table 2 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.4 數據處理

整理后的數據采用SPSS 22.0分析軟件進行統計學檢驗及方差分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白水解酶種類篩選結果

由預實驗測得本研究所用雞胸肉的蛋白質含量為23.30%，不同酶類的靶點存在很大的差異性，因此其水解產物也有很大不同，會呈現多種風味和水解效果。

圖1 不同蛋白酶對雞胸肉水解度的影響Fig. 1 Effect of different proteases on hydrolysis degree of chicken breast proteins

6 種蛋白酶的酶解液均呈淡黃色、澄清狀，并無感官上的差異。由圖1可知，在相同的水解工藝條件下，6 種蛋白酶均對雞胸肉蛋白質有水解作用，水解效果較好的是復合蛋白酶和木瓜蛋白酶，二者水解雞胸肉時的水解度分別為24.68%和23.55%，顯著高于其他蛋白酶（P＜0.05）。

圖2 雞胸肉酶解液的感官評分Fig. 2 Sensory scores of chicken enzymatic hydrolysates

由圖2可知，使用肉類水解專用酶得到的酶解液略苦且味道寡淡，而風味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解液鮮味濃郁，醇厚豐滿。總體來說，6 種蛋白酶制得的雞胸肉蛋白酶解液均呈現出鮮味突出、醇厚感、持續感較強、甜味平淡、苦味和酸味不明顯的感官特點，各試驗組均有較佳風味。陳怡穎等[23]的研究中曾經提到，在動植物蛋白酶酶解過程中，會出現苦味、腥味，但在本研究中未發現，這可能與雞肉特有的氨基酸模式相關，其內部含有大量的鮮味氨基酸，而苦味氨基酸相對較少。Ner[24]的研究表明，一般苦味較重主要是肽鏈末端存在大量的疏水性氨基酸所致。在本研究中，雞胸肉水解時，其內部的疏水性氨基酸被包裹在肽鏈內，并沒有游離出來，與味蕾接觸，因而風味相對比較甘甜。

在本研究中的同一水解工藝下，使用6 種蛋白酶對雞胸肉進行酶解制得產品的感官接受程度無太大差異。因此，最終選擇對雞胸肉水解度較高的復合蛋白酶和木瓜蛋白酶進行復配。

2.2 木瓜蛋白酶與復合蛋白酶復配的選擇

由圖3可知，對于雞胸肉，復配蛋白酶的水解效果均遠優于單酶（P＜0.05），這是由于每種酶對肽鍵的水解具有專一性[25]，復配蛋白酶可以多位點水解蛋白質。當木瓜蛋白酶與復合蛋白酶復配比例為1∶2時，得到的酶解液的水解度在各試驗組中最高，達31.20%。對于雞胸肉，復合蛋白酶的單酶水解效果強于木瓜蛋白酶（P＜0.05），因此，后期將2 種單酶進行復配時，應考慮增大復合蛋白酶用量，以得到更好的水解效果。

圖3 木瓜蛋白酶與復合蛋白酶復配對雞胸肉水解度的影響Fig. 3 Effect of papain and protamex formulation on hydrolysis degree of chicken breast proteins

2.3 復配蛋白酶水解條件的單因素試驗結果

圖4 酶解時間對雞胸肉水解度的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree of chicken breast proteins

由圖4可知，隨著酶解時間的延長，經復配蛋白酶處理的雞胸肉水解度持續增加，當酶解時間為4.0 h時，水解度增加速率開始變慢。根據姚宏亮等[26]的報道，采用水解法對禽肉進行水解，其水解度為30%時，出現最佳風味，當水解度不斷增加，超過30%時，禽肉酶解液反而會出現苦味。本研究中，當酶解時間大于4.0 h時，雞肉蛋白酶解液的水解度超過30%，因此，綜合考慮效率及成本問題，復配蛋白酶水解時間選4.0 h為宜。

圖5 酶解溫度對雞胸肉水解度的影響Fig. 5 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree of chicken breast proteins

由圖5可知，當復配蛋白酶的酶解溫度為55 ℃時，雞胸肉酶解液的水解度遠高于其他溫度條件，且差異顯著（P＜0.05）。在復配蛋白酶對雞胸肉蛋白質的作用過程中，其水解度會隨著溫度的升高先升高后降低。這種變化趨勢主要是由于低溫時水解反應占據主導地位，酶的活性不斷增強，并且相對穩定，水解效率相對較高；后期隨著溫度升高到一定的程度和限度，其內部的水解反應速率增加，但酶失去自身活性的速率也在加快，底物生成產物的速率也在不斷降低，酶解效率降低[27]，穩定性較差，因而，復配蛋白酶的最佳酶解溫度為55 ℃。

圖6 復配蛋白酶總酶量對雞胸肉水解度的影響Fig. 6 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree of chicken breast proteins

由圖6可知：復配蛋白酶的總酶量在1.0%～1.5%的范圍內不斷增加時，雞胸肉酶解液的水解度增長較快（P＜0.05）；當總酶量從1.5%增加到3.0%時，雞胸肉酶解液的水解度基本無變化（P＞0.05）。這主要是由于底物量有限，在底物反應速率不斷提升的過程中，底物容量有限，會被消耗殆盡；在沒有底物繼續參加反應時，無法提高其水解度。為了節約酶用量、降低成本，確定水解雞胸肉蛋白質時的復配蛋白酶最適總酶量為1.5%。

圖7 固液比對雞胸肉水解度的影響Fig. 7 Effect of solid-solvent ratio on hydrolysis degree of chicken breast proteins

由圖7可知，在固液比不斷減小的過程中，雞胸肉酶解液的水解度先增加后變小，水解度最高峰值為30.90%，此時的固液比為1∶4。固液比的變化影響底物濃度，底物濃度高即溶質多，由于缺乏流動性，不能與酶進行充分的接觸，從而不能充分進行反應；在底物濃度相對較小時，其內部的流動性比較好，有利于酶解反應的進行[28]。當底物濃度減小到一定程度時，二者接觸的幾率較小，反應有限，此時水解度較低[29]。在底物濃度較低時，水的用量會增大，不利于后續干燥濃縮等操作。因此，復配蛋白酶水解雞胸肉的最適固液比為1∶4。

圖8 復合蛋白酶與木瓜蛋白酶復配比例對雞胸肉水解度的影響Fig. 8 Effect of protamex/papain ratio on hydrolysis degree of chicken breast proteins

由圖8可知，隨著復合蛋白酶與木瓜蛋白酶復配比例的增大，雞胸肉蛋白的水解度總體呈現先升高后降低的趨勢。當復合蛋白酶與木瓜蛋白酶復配比例為3∶1時，雞胸肉酶解液的水解度達32.62%，顯著高于其他試驗組（P＜0.05）。造成水解度先升高后降低的原因可能是在水解能力上，復合蛋白酶比木瓜蛋白酶效果好（圖3），在復合蛋白酶的量不斷增加的同時，其水解度也趨于增加；但當二者的量超過一定限度時，會產生互為底物的反應，相互進行水解，通常由具有較強活力的酶水解活力較弱的酶，導致部分酶的活性大大降低，從而在水解雞胸肉方面的效率明顯降低，最終導致水解度下降。因此，可以確定復合蛋白酶與木瓜蛋白酶的最適復配比例為3∶1。

2.4 復配蛋白酶水解條件的響應面試驗結果

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken experimental design with experimental results

根據單因素試驗結果，綜合考慮效率及成本問題，復配蛋白酶水解時間不宜過長，且通過單因素試驗已經確定復配蛋白酶的水解時間為4 h為宜。采用響應面Box-Behnken設計29 組試驗（其中5 組為中心點重復試驗）[30]，以雞胸肉蛋白質水解度為響應值，考察酶解反應體系中固液比（A）、復配蛋白酶添加量（B）、復合蛋白酶與木瓜蛋白酶復配比例（C）及酶解溫度（D）對雞胸肉蛋白質水解度的影響。響應面試驗結果及分析如表3～4所示。

表4 響應曲面二次回歸模型的方差分析結果Table 4 Analysis of variance of quadratic regression model

由表4可知，該試驗模型P值＜0.01，說明不同試驗組別間差異極顯著，4 個自變量，即固液比（A）、復配蛋白酶添加量（B）、復合蛋白酶與木瓜蛋白酶復配比例（C）及酶解溫度（D）之間存在顯著的線性關系，方法具有較高的可靠性。失擬項Prob＞F為0.546 1＞0.05，差異不顯著，表明實驗誤差小。模型擬合系數R2=0.978 5，校正擬合系數為R2Adj=0.957 0，表示該模型能夠解釋水解度有95.70%的變化來自所選變量，不能解釋的部分僅為4.30%。提示該模型適合用于研究所選4 個因素的變化對雞胸肉蛋白質水解度的影響和預測分析。信噪比為19.976，信噪比在4以上，提示模型擬合度和可信度較高。采用Desgin-Expert 8.06程序進行二次多項式回歸，得到的方程為水解度＝-188.285 75＋11.226 24A＋21.091 11B-0.938 80C＋6.875 26D＋1.141 00AB＋0.493 83AC-0.085 65AD＋3.181 50BC-0.220 81BD-0.013 40CD-1.298 33A2-5.754 64B2-1.129 43C2-0.058 45D2。

對上述方程的回歸系數進行顯著性檢驗表明，因素A、C、AC、AD對雞胸肉蛋白質水解度的影響顯著（P＜0.05），因素D以及AB、BC、BD的兩兩因素交互作用對雞胸肉蛋白質水解度的影響極顯著（P＜0.01）。

圖9 固液比和復配蛋白酶添加量交互影響雞胸肉蛋白質水解度的響應曲面圖及等高線圖Fig. 9 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of solid/solvent ratio and enzyme dosage on hydrolysis degree of chicken breast proteins

圖10 固液比和復合蛋白酶與木瓜蛋白酶復配比例交互影響雞胸肉蛋白質水解度的響應曲面圖及等高線圖Fig. 10 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of solid/solvent ratio and protamex/papain ratio on hydrolysis degree of chicken breast proteins

圖11 固液比和酶解溫度交互影響雞胸肉蛋白質水解度的響應曲面圖及等高線圖Fig. 11 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of solid/solvent ratio and hydrolysis temperature on hydrolysis degree of chicken breast proteins

圖12 復配蛋白酶添加量和復合蛋白酶與木瓜蛋白酶復配比例交互影響雞胸肉蛋白質水解度的響應曲面圖及等高線圖Fig. 12 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of enzyme dosage and protamex/papain ratio on hydrolysis degree of chicken breast proteins

圖13 復配蛋白酶添加量和酶解溫度交互影響雞胸肉蛋白質水解度的響應曲面圖及等高線圖Fig. 13 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of enzyme dosage and hydrolysis temperature on hydrolysis degree of chicken breast proteins

圖14 復合蛋白酶與木瓜蛋白酶復配比例和酶解溫度交互影響雞胸肉蛋白質水解度的響應曲面圖及等高線圖Fig. 14 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of protamex/papain ratio and hydrolysis temperature on hydrolysis degree of chicken breast proteins

由圖9～14可知，AB、AC、AD、BC、BD、CD的兩因素交互作用響應曲面圖呈拋物線狀，存在峰值。隨著固液比、復配蛋白酶添加量、復合蛋白酶與木瓜蛋白酶復配比例或酶解溫度的不斷增加，雞胸肉蛋白質水解度呈現先升后降的趨勢。其中，固液比、復合蛋白酶與木瓜蛋白酶復配比例、酶解溫度對水解度影響較大。圓形等高線提示兩因素交互作用不強，橢圓形、馬鞍形等高線提示兩因素具有明顯的交互作用。除CD兩因素交互作用的等高線圖為圓形外，其余兩因素的等高線圖均為橢圓形，說明CD兩因素的交互作用不顯著，其余兩兩因素之間交互作用顯著（或極顯著）。響應曲面圖及等高線圖結果與回歸模型方差分析的結果一致。

2.5 驗證實驗結果

根據Box-Behnken試驗設計所得的結果和二次多項回歸方程，通過Design Expert V8.0.6軟件預測出雞胸肉蛋白的最佳酶解條件為固液比1∶4.20、復配蛋白酶添加量2.16%、復合蛋白酶與木瓜蛋白酶復配比例3.24∶1、酶解溫度51.29 ℃（實際實驗過程取51.30 ℃）。在上述條件下，雞胸肉的蛋白水解度達32%以上，可以通過在最佳水解條件下進行水解來監測模型精確度，進行3 組平行實驗，雞胸肉的蛋白水解度為（32.71±0.51）%，從而可以得到通過響應面分析法對其最佳酶解條件進行優化是可行的。

2.6 雞胸肉蛋白酶解液的氨基酸成分分析

根據優化得到的最佳工藝條件制備雞胸肉蛋白酶解液，并對其進行游離氨基酸含量測定。17 種游離氨基酸在肉類風味中發揮著重要的作用[31]，在制備肉味香精的過程中，更容易發生反應[32-34]。

表5 雞胸肉蛋白酶解液的氨基酸成分分析Table 5 Analysis of amino acid composition of chicken breast enzymatic hydrolysate

由表6可知，17 種游離氨基酸在雞胸肉蛋白酶解液中的含量相對豐富，高達9.23%。雞胸肉蛋白酶解液含有人體所需的8 種氨基酸，且含量較高，占酶解液游離氨基酸總量的50.16%，6 種鮮味氨基酸占總量的38.24%。此外，蛋氨酸、半胱氨酸等含硫氨基酸也在酶解液中有所體現。由此可見，利用木瓜蛋白酶和復合蛋白酶復配，酶解雞胸肉蛋白得到的酶解液是一種氨基酸效價高且全的動物蛋白水解液，且由于含有大量呈味氨基酸和含硫氨基酸，該酶解液亦能作為肉味香精前體物。

3 結 論

基于單因素試驗設計，以雞胸肉蛋白水解度為響應值，通過4因素3水平的Box-Behnken響應面試驗設計，優化得到在pH值7.00、酶解時間4 h時，雞胸肉蛋白酶解的最佳工藝條件為：選擇復合蛋白酶和木瓜蛋白酶進行復配，復合蛋白酶與木瓜蛋白酶復配比例3.24∶1、復配蛋白酶添加量2.16%、酶解溫度51.29 ℃、固液比1∶4.20。通過此工藝條件制得的雞胸肉蛋白酶解液的水解度達到32%左右，與軟件預測結果一致。

使用雷達圖進行感官分析可以直觀地看出，雞胸肉蛋白酶解液的風味主要體現在鮮味、持續感和醇厚感上，這些風味特色是作為熱反應前體物質的重要條件，因此，使用這些指標來篩選復配蛋白酶的種類較為合適。在復配2 種蛋白酶時，本研究不僅將復配蛋白酶和單酶的水解能力進行比較，還將2 種單酶的復配比例進行正負向比較，進而確定出2 種單酶復配的比例方向。本研究得到的雞胸肉蛋白酶解液外觀呈淡黃色、澄清狀，肉香濃郁，鮮味明顯，無苦味、腥味；其中人體必需氨基酸和呈味氨基酸含量均較高，在營養和食品方面具有較高的使用價值。