多環(huán)芳烴分子印跡柱-高效液相色譜熒光檢測法快速測定烤肉中15 種多環(huán)芳烴

陽文武，譚順中，郭 婭,*，周 濃

（1.重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404000；2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404000）

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是由2 個或2 個以上苯環(huán)稠合而成的一類芳香族化合物，主要由有機(jī)物質(zhì)（包括油、木材、垃圾廢物和煤）的熱解和不完全燃燒產(chǎn)生，在食品加工過程（如熏、烤、烘培、煎、炸等）中可能產(chǎn)生PAHs。PAHs具有“三致”（致癌、致畸和致突變）毒性，屬于持久性有機(jī)污染物[1-3]。歐盟委員會835/2011號文件《Amending regulation（EC） No 1881/2006 as regards maximum levels for polycyclic aromatic hydrocarbons in foodstuffs》規(guī)定，熏、燒、烤肉制品中苯并（a）芘的限量為2 μg/kg（歐盟委員會No1881/2006號文件《Setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs》規(guī)定限量為5 μg/kg），且PAH4（?、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽、苯并（a）芘）的總量不大于12 μg/kg（歐盟委員會No1881/2006號文件規(guī)定總量不大于30 μg/kg），而我國GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中僅對PAHs中的苯并（a）芘規(guī)定了限量為5 μg/kg（GB 2762—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中也為5 μg/kg），暫未對其他PAHs規(guī)定限量值。鑒于烤肉在日常生活中的重要性，對烤肉中PAHs的含量水平進(jìn)行監(jiān)測對確保烤肉安全具有十分重要的意義。

目前，關(guān)于PAHs污染情況的文獻(xiàn)報道集中在水[4-6]、大氣[7-9]、土壤[10-12]及食用油[13-15]等方面，對烤肉中PAHs的污染狀況卻鮮有報道。檢測PAHs的方法主要有高效液相色譜-熒光檢測（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）法[16-18]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[19-21]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法[22-24]等，大部分已有報道多采用索氏提取法[25-27]、超聲波提取法[28-30]等。索氏提取法整個過程耗時長，有機(jī)溶劑用量大，不適合實驗室大批量的檢驗工作，本研究用少量乙腈超聲提取后，采用多環(huán)芳烴分子印跡柱（molecular imprinting column of PAHs，MIP-PAHs）凈化，凈化后的樣品進(jìn)行HPLC-FLD檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烤鴨（15 批次）、烤雞肉（2 批次）、烤肉（2 批次）、烤羊肉（2 批次）、烤牛肉（3 批次）樣品購自重慶市東北片區(qū)（包括萬州區(qū)、梁平區(qū)、忠縣、開州區(qū)、云陽縣、奉節(jié)縣、巫山縣、巫溪縣及城口縣）不同攤位。

乙腈、正己烷、二氯甲烷（均為色譜純） 北京迪馬科技有限公司；15 種PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 北京曼哈格生物科技有限公司；苊、芴、芘、菲、蒽、萘、熒蒽、苯并（a）蒽、苯并（a）芘、二苯并（a,h）蒽、苯并（b）熒蒽、茚并（1,2,3-c,d）芘、苯并（k）熒蒽、苯并（g,h,i）苝、?標(biāo)準(zhǔn)溶液 美國ChemService公司；MIP-PAHs 德國CNW公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（配備熒光檢測器）美國安捷倫科技有限公司；KH-2000DB超聲波清洗器昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；摩爾基因型1850C超純水機(jī)上海摩勒科學(xué)儀器有限公司；IKA MS3渦旋振蕩器德國IKA公司；Waters固相萃取裝置 美國Waters公司；Sartorius SQP分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；BiotageTurboVap2氮吹儀 瑞典Biotage公司；4-16S離心機(jī) 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

單標(biāo)溶液配制：分別準(zhǔn)確量取各種單標(biāo)溶液適量，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為10 ng/mL的單標(biāo)溶液。

PAHs標(biāo)準(zhǔn)中間液配制：準(zhǔn)確移取0.1 mL PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（15 種PAHs的質(zhì)量濃度均為200 μg/mL）于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，得質(zhì)量濃度為200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，4 ℃保存，有效期為3 個月。

PAHs標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：分別準(zhǔn)確移取0.05、0.25、0.50、1.00、2.50 mL PAHs標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成質(zhì)量濃度分別為1、5、10、20、50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

樣品提取：稱取2 g（精確到0.000 1 g）試樣于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩30 s后，超聲提取30 min，4 500 r/min離心5 min；吸取上清液于氮吹管中，下層用10 mL乙腈重復(fù)提取1 次，合并提取液于氮吹管中，35 ℃氮吹至近干；加入5 mL正己烷，渦旋振蕩30 s溶解，待凈化。

樣品凈化：依次用5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷活化MIP-PAHs固相萃取柱，將待凈化溶液全部上樣，用2 mL正己烷洗滌氮吹管并入柱中，用正己烷淋洗2 次，每次3 mL，棄去淋洗液，再用10 mL二氯甲烷洗脫并收集凈化液至離心管；35 ℃氮吹至近干，用乙腈定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.3 儀器條件

色譜柱：Waters PAHs C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈和水；柱溫35 ℃；流速1.2 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；對流動相梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 方法的線性范圍、檢出限及定量限測定

在優(yōu)化所得測定條件下，對配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定，以待測PAHs的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，各PAHs的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白基質(zhì)中依次加入較低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行測定，以3 倍信噪比（RS/N=3）和10 倍信噪比（RS/N=10）分別確定方法的檢出限和定量限。

1.3.5 方法的回收率和精密度測定

稱取2 g（精確到0.000 1 g）空白試樣，分別進(jìn)行5.0、10.0、25.0 μg/kg 3 個加標(biāo)水平的基質(zhì)加標(biāo)回收實驗，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行樣品前處理，并進(jìn)行HPLC-FLD分析，計算平均回收率和方法精密度（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD））。每個添加水平均平行測定6 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品凈化方式的選擇

稱取空白樣品，按照10.0 μg/kg的添加水平進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，比較MIP-PAHs和以900 mg硫酸鎂、100 mg N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、100 mg C18為填料的凈化管2 種凈化方式對烤肉樣品的凈化效果。

表1 2 種凈化方式回收率的比較Table 1 Comparison of recovery rates of two purification methods

由表1可知，MIP-PAHs和以900 mg硫酸鎂、100 mg PSA、100 mg C18為填料的凈化管凈化的回收率分別為80.6%～95.8%和60.7%～75.7%，MIP-PAHs固相萃取柱的分析結(jié)果優(yōu)于以900 mg硫酸鎂、100 mg PSA、100 mg C18為填料的凈化管，因此選擇MIP-PAHs凈化。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

流速和流動相的不同配比直接影響PAHs的出峰時間及分離效果，考察表2～3中的2 種儀器條件對PAHs分離效果的影響。由圖1可知，以表3中的參數(shù)作為儀器條件時，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖的基線不平，以表2中的參數(shù)作為儀器條件時，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖的基線平穩(wěn)，且空白加標(biāo)樣品可以實現(xiàn)較好地分離。

表2 流動相洗脫梯度、流速及熒光檢測器梯度（1）Table 2 Mobile phase gradient program, fl ow rate and fl uorescence detection gradient (1)

表3 流動相洗脫梯度、流速及熒光檢測器梯度（2）Table 3 Mobile phase gradient program, fl ow rate and fl uorescence detection gradient (2)

圖1 不同色譜條件下標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白加標(biāo)樣品的色譜圖Fig. 1 Chromatogram of standard solution and spiked blank sample under different chromatographic conditions

2.3 方法的線性范圍、檢出限及定量限

表4 方法的線性范圍、檢出限及定量限Table 4 Linear ranges, LODs and LOQs of the method

由表4可知，用HPLC-FLD法測定時，PAHs在質(zhì)量濃度1～50 ng/mL線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，r＞0.999 5，方法檢測限為0.33～3.30 μg/kg，定量限為1.0～10.0 μg/kg。

2.4 方法的回收率和精密度

表5 方法回收率和RSDs（n=6）Table 5 Recovery and precision (RSDs) of the method (n= 6)

由表5可知，HPLC-FLD法中各PAHs在5.0、10.0、25.0 μg/kg 3 個加標(biāo)水平的回收率分別為71.1%～90.5%、80.6%～96.8%及83.0%～98.8%，RSD分別為1.8%～5.8%、1.5%～4.7%及1.0%～3.6%，表明方法準(zhǔn)確度和精密度均滿足分析要求。

表6 樣品PAHs含量測定結(jié)果Table 6 PAHs contents of real samples

2.5 實際樣品測定

按照1.3.2節(jié)處理樣品，將處理好的樣品在優(yōu)化所得條件下進(jìn)行測定，外標(biāo)法定量。

由表6可知：15 種PAHs在24 份烤肉樣品中均有檢出，其中烤雞肉2和烤肉1中苯并（a）芘含量大于5.0 μg/kg；烤鴨13、烤肉2和烤羊肉1中苯并（a）芘含量大于2.0 μg/kg，且PAH4（?、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽、苯并（a）芘）總量均大于12.0 μg/kg；烤雞肉1和烤牛肉2中苯并（a）芘含量小于2.0 μg/kg，但PAH4總量均大于12.0 μg/kg；24 份烤肉樣品中有2 份不符合我國標(biāo)準(zhǔn)，7 份不符合歐盟標(biāo)準(zhǔn)。由此可見，單一控制苯并（a）芘的含量不足以保證烤肉的質(zhì)量，為提高其安全性，且與國際接軌，應(yīng)盡快提高我國熏、燒、烤肉制品中PAHs的限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié) 論

比較MIP-PAHs和以900 mg硫酸鎂、100 mg PSA、100 mg C18為填料的凈化管2 種凈化方式對烤肉樣品的凈化效果，結(jié)果表明：采用MIP-PAHs凈化時，空白樣品加標(biāo)回收率高，且能減少其他物質(zhì)對目標(biāo)物的干擾。流速和流動相的不同配比直接影響PAHs的出峰時間及分離效果。在進(jìn)行預(yù)實驗時，參照GB 5009.265—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多環(huán)芳烴的測定》中的色譜條件，但標(biāo)準(zhǔn)溶液中的15 種PAHs目標(biāo)物分離不理想，且基線不平，最終通過不斷摸索確定了本研究中的色譜條件。

本研究用少量乙腈超聲提取樣品后，采用MIP-PAHs凈化，凈化后的樣品進(jìn)行HPLC-FLD檢測。結(jié)果表明，烤肉中15 種PAHs的加標(biāo)回收率為71.1%～98.8%，RSD為1.0%～5.8%，該方法高效、快速、靈敏度高，可以用于烤肉中15 種PAHs的定量分析。