耐鹽促生菌株B7的篩選及其在黃瓜上的應用

錢蘭華 李婧 王桃云

摘要 本文綜述了一種提高作物耐鹽能力促生菌的篩選及其應用。通過對沿海灘涂鹽堿地土壤中的微生物進行分離純化，并采用耐鹽和解鹽試驗對分離純化出的根際微生物進行耐鹽促生篩選，得到高耐鹽活性促生菌B7。對B7的16S rDNA、生理生化性質及促生能力進行測定，最后采用培養皿法和盆栽法對B7提高黃瓜耐鹽能力進行測試。結果表明，該菌株耐鹽度為6%，利用B7制備的微生物菌劑能在鹽脅迫下顯著提高黃瓜的耐鹽能力，減緩鹽害現象，增加生物量，達到促進黃瓜生長的效果。

關鍵詞 促生菌；耐鹽能力；耐鹽菌株B7；黃瓜

中圖分類號 S156.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）19-0122-03

隨著社會的發展和人口的增加，人們對耕地資源的需求也越來越多。土壤鹽漬化是指土壤底層或地下水的鹽分隨毛管水上升到地表，水分蒸發后，使鹽分積累在表層土壤中的過程；易溶性鹽分在土壤表層積累的現象或過程，也稱鹽漬化。除濱海地區由于受海水浸漬影響而發生鹽堿化外，干旱和半干旱地區發展設施農業也是引起土壤次生鹽漬化的重要原因[1-2]。土壤鹽漬化是當前威脅全球農業生產和農作物產量的主要非生物脅迫因子之一。目前，全球有50%的灌溉土地受到不同程度的鹽脅迫，中國鹽漬土（或稱鹽堿土）的分布范圍廣、面積大、類型多，總面積約1億hm2，而且威脅面積逐年增加。如何改良和利用大面積鹽漬化土地，以及保護并提高重要經濟作物抵抗鹽脅迫的能力是當今國際社會亟待解決的重要科技問題[3-5]。目前，主要生物改良方法有培育并種植耐鹽堿作物，如種植高粱、甜菜、向日葵以及耐鹽植物檉柳、沙蓬草、紫穗槐等；此外，還有對耐鹽轉基因植物的研究，但該類方法周期長、花費大，且未被社會廣泛接受和認可。

根際微生物是指在植物根系土壤范圍內生長繁殖的細菌、放線菌、真菌等微生物。大多數根際微生物對植物無害或對植物生長有促進作用，部分微生物還具有固氮、溶磷、產生植物生長激素和鐵載體以及誘導植物抗性的功能。利用根際微生物提高鹽堿地作物耐鹽促生的方法具有投資少、見效快、效益高等特點。因此，有關根際微生物耐鹽促生的功能活性研究已經受到研究者的廣泛關注。從沿海灘涂土壤中分離篩選耐鹽性菌株，可用于提高作物耐鹽能力，同時可為耐鹽基因的克隆及轉基因耐鹽植物的構建奠定基礎。本文綜述了耐鹽性促生菌株B7在鹽脅迫中促進作物發芽和生長的應用及其微生物菌劑制備方法，以期為耐鹽性促生菌株B7的應用研究提供參考。

1 土壤芽孢桿菌菌株B7

1.1 耐鹽菌株的分離及篩選

2017年7月6日，從江蘇鹽城沿海灘涂的鹽堿地土壤采集土樣15份，各取土樣1 g懸浮于100 mL無菌水中，并以此稀釋至105倍。采用LB培養基進行篩選，利用NaCl濃度為2%、4%、6%、8%、10%的NA培養基逐級篩選耐鹽菌株。用移液器分別取土壤稀釋液0.1 mL涂布于2種培養基平板上，30 ℃培養2～3 d，選取在6%鹽濃度下生長良好的菌落，經反復劃線純化后保存備用，篩選得到1株耐鹽菌株B7。耐鹽促生菌株B7具有耐鹽促生活性，最適生長溫度為30 ℃，菌落較小、白色、隆起、邊緣整齊、表面光滑濕潤、不透明，為好氧型化能異養菌。菌株B7的平板培養菌落如圖1所示。

1.2 耐鹽菌株B7的鑒定

1.2.1 細菌分子遺傳學分類鑒定。以菌株B7的DNA為模板、16S rDNA通用引物為引物，對16S rDNA片段進行擴增。將擴增的片段直接進行序列測定。將測序的結果輸入NCBI網站上的BLAST程序進行比對，結果顯示，該菌株的16S rDNA序列與GenBank基因庫中芽孢桿菌屬Bacillus meg-aterium的16S rDNA序列同源度最高，同源率達到100%。通過DNAMAN6.0對GenBank中已有的芽孢桿菌屬的16S rDNA序列進行遺傳進化分析，結果顯示，菌株B7的16S rDNA與Bacillus megaterium同源性最高。因此，可以初步判定該菌株為芽孢桿菌屬的巨大芽孢桿菌。

1.2.2 生理生化測定。參考《常見細菌系統鑒定手冊》，對耐鹽菌株進行生理生化測定，初步鑒定為革蘭氏陽性，吲哚反應陽性，能水解淀粉和葡萄糖，能液化明膠；伏-普試驗反應陰性、甲基紅反應陰性，硫化氫陰性，檸檬酸鹽試驗陰性。

根據上述對該菌株遺傳特性和生理生化特性的測定結果，確定從鹽堿地土壤中篩選到的耐鹽性促生菌株B7為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

1.3 耐鹽菌株B7的耐鹽性分析

將分離純化的耐鹽菌株B7菌懸液，分別轉接相同量到不同鹽濃度的液體培養基中，在30 ℃、130 r/min條件下搖床培養，觀察生長情況，24 h后測其在600 nm波長處的吸光值，以確定細菌耐鹽程度。耐鹽性結果如圖2所示，可見耐鹽菌株B7對氯化鈉有較寬的適應范圍，菌株在無鹽情況下不發生自溶現象，在鹽濃度達到6%情況下仍然可保持較高的菌體濃度，在0～6%的鹽濃度下均可生長，最適鹽濃度為4%～6%。

2 菌株應用試驗

2.1 菌株菌懸液制備方法

挑取在LB固體平板生長48 h的耐鹽菌株B7單菌落，接種于250 mL LB液體培養基中，在30 ℃、130 r/min條件下搖瓶培養48 h后，待菌體生長至對數生長期，放入無菌離心管中12 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體，用無菌水洗滌菌體2次后，再用無菌水調節菌體的吸光值為0.5～0.6，作為生物菌劑。

2.2 黃瓜種子培養皿發芽試驗

取適量未經處理的黃瓜種子放入燒杯中進行消毒滅菌，先用75%乙醇（沒過種子）浸泡1 min，然后倒出乙醇溶液，再加入現配的0.1%氯化汞浸泡1 min，然后倒出氯化汞溶液，最后用無菌水清洗3次，備用。準備適量的培養皿，將脫脂棉平鋪在培養皿底層，蓋好后滅菌待用；配制200 mmol/L氯化鈉溶液，滅菌后備用。試驗設4個處理，分別為空白對照組、耐鹽菌株組、鹽脅迫組和鹽脅迫+耐鹽菌株組。其中，鹽脅迫組、鹽脅迫+耐鹽菌株組加200 mmol/L NaCl溶液（沒過脫脂棉），空白對照組和耐鹽菌株組加蒸餾水，3次重復。每個培養皿中放入40個種子（空白對照組和鹽脅迫組的種子用無菌水浸泡6 h，耐鹽菌株組和鹽脅迫+耐鹽菌株組的種子用B7菌液浸泡6 h）。將上述已完成所有步驟的培養皿放入光照培養箱中25 ℃培養7 d（前3 d暗培養，后4 d 為12 h光照培養、12 h暗培養）。

試驗結束后，記錄黃瓜種子發芽率、鮮重和干重。試驗結果如圖3、表1所示。結果表明，耐鹽菌株B7+鹽脅迫處理組的種子發芽率、鮮重分別是鹽脅迫組的1.25倍和1.23倍，說明耐鹽菌株B7對黃瓜種子具有明顯的耐鹽促生作用。

2.3 黃瓜盆栽試驗

將黃瓜種子用溫水浸泡過夜后，先用75%乙醇（沒過種子）浸泡1 min后倒出，再加入現配的0.1%氯化汞浸泡1 min后倒出，最后用已滅過菌的蒸餾水清洗3次，備用。用營養土與蛭石（體積比4∶1）混合配制盆栽基質，121 ℃滅菌1 h，冷卻后裝至栽培盆（10 cm×10 cm×10 cm）中，每盆裝入200 g。分別設置空白對照（無鹽脅迫）、鹽脅迫和鹽脅迫+B7菌株3個處理，其中鹽脅迫+B7菌株處理的種子先用菌株B7菌液浸泡6 h、空白對照和鹽脅迫處理的種子用滅菌水浸泡6 h，5次重復。每盆播入處理好的黃瓜種子3粒，然后空白組用無菌水澆灌、鹽脅迫組和鹽脅迫+B7菌株組用菌株B7菌液混合200 mmol/L NaCl溶液澆灌，每周澆灌1次，其余時間澆灌無菌水。出苗后，計算發芽率和出苗率；然后每盆保留1株幼苗，1個月后測定總根長、總投影面積、總根表面積、平均根系直徑和根尖數等生長指標及葡萄糖、賴氨酸含量等生理指標（表2、3）。

3 植物耐鹽促生劑的制備

挑取已在LB固體平板上生長48 h的耐鹽菌株B7單菌落，接種于250 mL LB液體培養基中，在30 ℃、130 r/min條件下搖瓶培養48 h，待菌體生長至對數生長期，放入無菌離心管中12 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體，用無菌水洗滌菌體2次后，無菌水調節菌體的吸光值為0.6，即得植物耐鹽促生劑。

4 結語

本文綜述了耐鹽性促生菌株B7的分離、篩選、鑒定及耐鹽性分析，通過遺傳特性和生理生化特性測定，確定該菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；通過耐鹽度分析、鹽脅迫條件下的黃瓜種子發芽及盆栽試驗中對黃瓜的耐鹽促生作用分析，表明該菌株耐鹽度為6%，同時發現利用耐鹽菌株B7制備的微生物菌劑能在鹽脅迫下顯著提高黃瓜耐鹽能力，減緩鹽害現象，增加生物量，達到促進黃瓜生長的效果，有助于提高黃瓜的耐鹽性，減少化學肥料的使用。因此，該菌劑具有廣泛的應用前景。

5 參考文獻

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