產纖維素酶菌株的篩選與鑒定及發酵條件優化研究

李美霖 郭東會 馮惠萍

摘要 從枯樹葉及其覆蓋的土壤中篩選分離分解纖維素的菌株并進行16S rRNA鑒定，優化其發酵條件。采用CMC-剛果紅染色法初篩分解纖維素的菌株，用顯微鏡觀察其形態結構，用16S rRNA序列分析其系統分類地位。單因素試驗確定氮源、碳源、pH值和溫度對發酵液中羧甲基纖維素酶（CMC）、濾紙酶（FPA）活力的影響。結果表明，分離到1株高效分解纖維素的菌株SKX-1，鑒定SKX-1為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）；最優發酵條件為以蛋白胨為氮源、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為碳源，溫度37 ℃，pH值為7，發酵培養后，CMC酶活力達到173.3 U/mL，FPA酶活力達到210.5 U/mL。該試驗為菌株Bacillus cereus SKX-1的利用提供了理論基礎。

關鍵詞 蠟樣芽胞桿菌；菌株SKX-1；16S rRNA；發酵條件；優化；纖維素酶

中圖分類號 TQ925 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）19-0234-03

Abstract Bacterial strains of decomposing cellulose were screened from dead leaves and their covered soil and identified by 16S rRNA.The fermentation conditions were optimized.CMC-Congo red staining was used to screen decomposing cellulose strains，and its morphological structure was observed by microscope.Its systematic classification status was analyzed by 16S rRNA sequence.The effect of nitrogen，carbon，pH and temperature on the activity of CMC and FPA in fermentation broth were determined by single-factor test.The results showed that a strain of high-efficiency cellulose-decomposing（SKX-1） was isolated and identified as Bacillus cereus.The optimal fermentation condition for SKX-1 was taken peptone as nitrogen source，and CMC-Na as carbon source，the activity of CMC and FPA were 173.3 U/mL and 210.5 U/mL under the fermentation conditions of 37 ℃，pH=7.This experiment could provide a theoretical basis for the application of Bacillus cereus SKX-1.

Key words Bacillus cereus；SKX-1；16S rRNA；fermentation condition；optimization；cellulase

纖維素在地球上分布廣泛、蘊藏量豐富，普遍存在于植物中，具有可再生性，是可再生資源[1]。通過纖維素酶水解成葡萄糖等物質，進一步發酵生產酒精、單細胞蛋白、有機酸等人類急需的能源食物和化工原料等，不僅使纖維素得到了再次利用，而且對緩解人類食物緊缺以及化工原料等的枯竭具有重要意義。分解纖維素的菌株產生的酶廣泛應用于食品工業、飼料工業、紡織工業、造紙工業以及洗滌劑、醫藥等眾多領域。

近年來，能源和環境問題越來越受到人們的關注和重視，纖維素酶既可用于降解秸稈生產乙醇等新型能源，又可用于輔助秸稈還田，因而也日益受到關注[2-4]。但是，就目前而言，現有的纖維素酶產酶菌株的活力還遠遠不能滿足人們生產生活的需要，而且其生產成本過高，不能廣泛應用和大量生產。因此，選育酶活力強且高產的產纖維素酶菌株將會對人們的生產生活產生重要影響。

目前，很多能夠產生纖維素酶的生物尚未被人類發現和應用。因此，篩選分解纖維素的菌株對生產實踐具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

分解纖維素的菌株分離供試材料為泰山醫學院化學實驗樓后山楂樹下的土壤。

1.2 培養基

（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）。葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，自來水1 000 mL，自然pH值。

（2）種子培養基。葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，自來水1 000 mL，自然pH值。

（3）篩選培養基。羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉5 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂20 g，自來水1 000 mL，自然pH值。

（4）發酵培養基。CMC-Na 10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉5 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，自來水1 000 mL，自然pH值。

1.3 菌種的分離與純化

稱取新取的土壤樣品0.5 g于滅菌后的錐形瓶中，加入100 mL無菌水混合均勻后，于搖床28 ℃、200 r/min振蕩培養72 h，稍作靜置后吸取上清液進行梯度稀釋，在篩選培養基平板上涂布稀釋液，放入培養箱28 ℃培養3 d后，周圍出現透明圈的菌落即為分解纖維素菌的菌落，將其挑出并接種到篩選培養基上進行多次篩選和純化操作。然后將經過反復多次篩選和純化后有透明圈的產纖維素酶菌株接到PDA培養基上培養3 d，用剛果紅溶液（1 mg/mL）覆蓋培養基上長出的菌落，20 min后棄去剛果紅溶液，再將NaCl溶液（1 mol/L）倒入其中，15 min后倒掉NaCl溶液，測量其透明圈的直徑與菌落直徑之比[5]。

1.4 菌種鑒定與保藏

1.4.1 形態觀察。肉眼觀察并記錄菌株的形態，根據觀察到的菌株形態對菌株的種類進行大體判斷。

1.4.2 PCR擴增16S rRNA序列。以培養后菌株的DNA為模板，2條引物分別為5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′和5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，進行PCR擴增16S rRNA序列。PCR反應體系共25 μL（TaqDNA聚合酶0.5 μL，模板1 μL，引物各1 μL，10×buffer 2.5 μL，雙蒸水17 μL，dNTP 2 μL）。PCR擴增步驟：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。在5 μL PCR產物中加入6×buffer 1.5 μL進行凝膠電泳（1%瓊脂糖凝膠）。將瓊脂糖凝膠電泳中顯示出條帶對應的PCR產物送到生工生物工程股份有限公司進行測序。在NCBI上通過BLAST程序將上述PCR產物測序得到的序列與已知16S rRNA序列進行比對[6]，比較所測序列與已知序列的同源性。

1.4.3 菌種保藏。將篩選出的菌株轉接到斜面培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱培養3 d，然后保存于4 ℃冰箱中；將菌株接種到種子培養基，于28 ℃、180 r/min搖床培養1 d，取500 μL種子培養基與500 μL 50%甘油充分混合，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.5 菌株生長曲線測定

于150 mL發酵培養基中接種篩選得到的純菌株，培養開時測定OD600，以后每隔12 h取樣1.5 mL測OD600，共測108 h，繪制菌株生長曲線。

1.6 酶活力測定

1.6.1 粗酶液制備。于150 mL發酵培養基中接種篩選得到的純菌株，在28 ℃、220 r/min條件下搖瓶培養3～4 d。取發酵液，在5 000 r/min離心機中離心10 min，細胞胞外酶液存在于上層清液中（粗酶液）。

1.6.2 DNS法測定產纖維素酶菌酶活[7-8]。

（1）葡萄糖標準曲線繪制。用100 mL容量瓶定容配制1 mg/mL標準葡萄糖母液備用。將上述標準葡萄糖母液分別稀釋成濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的葡萄糖溶液，各取2 mL。然后加入1 mL DNS試劑，沸水中煮沸8 min，冷卻，補加21.5 mL蒸餾水，待溶液冷卻至與室溫一致后，分別用分光光度計測定吸光度值，波長為540 nm，記錄吸光值，并繪制葡萄糖標準曲線。

（2）菌株羧甲基纖維素酶（CMC）活力測定[6，9]。在10.0 mL試管中加6.0 mL 1.0% CMC-Na溶液，再加不同培養時間的粗酶液2.0 mL，于50 ℃水浴鍋中酶解30 min，再加2.0 mL DNS試劑，沸水浴8 min，取出試管放到事先準備好的碎冰中冷卻至室溫。然后加蒸餾水至10.0 mL，用分光光度計測定吸光值，波長為540 nm，根據繪制的葡萄糖標準曲線計算酶的活力值。

（3）菌株濾紙酶（FPA）活力測定[9-10]。取10.0 mL試管加入1 cm×6 cm新華1號濾紙，然后加入pH值為7.0的緩沖液6.0 mL，再加入不同培養時間的粗酶液2.0 mL，于50 ℃水浴鍋中酶解30 min后，加2.0 mL DNS溶液，沸水浴8 min，將試管取出放入事先準備好的碎冰中冷卻，直至室溫，取出加蒸餾水至液面到達10.0 mL，置于分光光度計中測定吸光值，波長為540 nm，以繪制的葡萄糖標準曲線作為依據計算酶活力。

1.6.3 計算酶活力的方法。酶活力定義為：在50 ℃的溫度下，1 mL酶液在1 min內水解底物生成1 μg葡萄糖所消耗酶量為1個酶活力單位，單位為U/mL。計算公式如下：

1個酶活力單位E=1 000×V×C/T×V1。

式中，T為水解時間（min）；V為定容體積（mL）；C為測試液中葡萄糖含量（mg/10 mL）；E為樣品的酶活力（U/mL）；V1為吸取酶液的體積（mL）。

1.7 發酵條件的優化

1.7.1 氮源對產酶的影響。分別以蛋白胨、硫酸銨和尿素為單一氮源，將培養基置于200 r/min搖床培養，72 h后測定產酶活性。

1.7.2 碳源對產酶的影響。分別用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、紙漿、麩皮、瞿麥作單一碳源，將培養基置于200 r/min搖床培養，72 h后測定產酶活性。

1.7.3 培養基pH值對產酶的影響。分別配制發酵培養基的pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，于30 ℃、200 r/min搖床培養，72 h后測定各組纖維素酶活性。

1.7.4 培養溫度對產酶的影響。將斜面劃線菌種接種于發酵培養基中，然后將培養基分別置于28、30、33、37、40 ℃溫度條件下，200 r/min搖床培養72 h。培養結束后測定各組纖維素酶活性。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

從土壤中篩選得到數株產纖維素酶菌株，經過多次篩選操作以及純化操作，測定透明圈直徑記為H和菌落直徑記為C，計算兩者之比，最終選出酶活力較高的2株產纖維素酶菌株SKX-1、SKH-1，結果見表1。最后選擇SKX-1菌株做后續試驗。

2.2 菌株的鑒定

將SKX-1菌株進行PCR擴增，獲得的特異性條帶約為1.5 kb（圖1）。把瓊脂糖凝膠電泳中顯示出條帶的PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序工作，經測序得到了1 444 bp片段。在NCBI上通過BLAST程序將上述PCR產物測序得到的序列與已知16S rRNA序列進行比對，比較所測序列與已知序列的同源性。結果顯示，Genbank數據庫中同源性相近的均為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus），相似性達到99%。

2.3 菌株生長曲線

根據比濁法繪制菌株SKX-1的生長曲線（圖2），0～60 h處于延滯期，60～96 h處于指數期，96 h后進入穩定期。該曲線對后續菌株的發酵培養中確定菌種種齡有極大幫助，為后面的菌株發酵打下基礎。

2.4 發酵條件的優化

由圖3可以看出，SKX-1菌株以蛋白胨為氮源時，CMC、FPA酶活性最高；CMC以硫酸銨為氮源時酶活性次之；FPA以尿素為氮源時酶活性次之。

由圖4可以看出，SKX-1菌株以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為碳源時，CMC、FPA酶活性最高；CMC以瞿麥為碳源時酶活性次之，FPA以麩皮為碳源時酶活性次之；紙漿為碳源時，CMC、FPA酶活性最低。

由圖5可以看出，SKX-1菌株發酵培養pH值為7時，CMC、FPA酶活性最高。發酵液pH值5～9時，CMC酶活性為最高峰的80%以上；FPA酶活性偏堿和偏酸時酶活性很快降低。

由圖6可以看出，菌株SKX-1在37℃發酵培養時，CMC和FPA都達到最高酶活性。SKX-1菌株在25～37 ℃發酵培養中，CMC、FPA酶活性呈現遞增趨勢；達到37 ℃，纖維素酶活性出現高峰；40 ℃酶活性下降。

3 結論與討論

本試驗從腐爛枯葉土壤中篩選出1株產纖維素的菌株，經16S rRNA鑒定為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）。通過單因素試驗確定氮源、碳源、pH值和溫度對發酵液中CMC、FPA酶活力的影響；確定最優的發酵條件為：CMC-Na 10 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉5 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、自來水1 000 mL，溫度37 ℃，pH值7。最優發酵條件下，200 r/min搖床培養72 h，CMC酶活力達到173.3 U/mL，FPA酶活力達到210.5 U/mL。該試驗為菌株Bacillus cereus SKX-1的利用提供了理論基礎。

產纖維素酶的菌株非常廣泛，在真菌、放線菌、細菌上均有報道[11-12]，本研究又增添了1株產纖維素酶的菌株。1種分解纖維素的菌株難以在工業上實現將秸稈轉化為可利用資源，但是菌株中互生現象大量存在，可以將產纖維素酶的菌株混合培養，觀察纖維素的分解情況，混菌培養的方法有待進一步研究。若將混菌培養應用到實際生產中，將會對木材等含纖維素物質的分解以及環境保護具有重要意義[13]。

4 參考文獻

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