BMI1對依托泊苷抑制乳腺癌細胞MCF7增殖的影響

鄭立紅 魏鳳香 鄭毅 潘洪明 劉丹 陳萍 梅慶步 李鵬輝 余韜

[摘要] 目的 觀察BMI1對依托泊苷（ETOP）抑制體外培養的乳腺癌細胞增殖的影響及機制。 方法 選擇對數生長的乳腺癌細胞MCF7，分為空白對照組、實驗組（加ETOP）。采用MTT法檢測細胞活性，流式細胞術（FCM）測定各組MCF7腫瘤細胞凋亡率及細胞周期變化；應用免疫組化檢測MCF7 BMI1蛋白和ATM蛋白表達的變化。 結果 與對照組相比，實驗組對乳腺癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用（P<0.01）。細胞周期分析顯示，實驗組使乳腺癌細胞的S期細胞比例減小（P=0.018），G1期細胞比例增大（P=0.021）。ETOP能夠降低BMI1蛋白表達（P=0.008），增加ATM蛋白的表達（P<0.01）。 結論 ETOP能明顯抑制乳腺癌細胞的增殖，其機制可能與細胞周期發生停滯及其下調BMI1蛋白和增加ATM蛋白的表達而誘導細胞凋亡有關。

[關鍵詞] BMI1；依托泊苷；ATM；乳腺癌

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）27-0032-04

[Abstract] Objective To observe the effect of BMI1 on Etoposide inhibiting proliferation of breast cancer cell MCF7 and its mechanism. Methods The breast cancer cells MCF7 grown in logarithm were selected and divided into blank control group and experimental group（added with ETOP）. The cell viability was detected by MTT assay. The apoptosis rate and cell cycle of MCF7 tumor cells were detected by flow cytometry（FCM）. The expression of MCF7 BMI1 protein and ATM protein were detected by immunohistochemistry. Results Compared with the control group， the experimental group had a significant inhibitory effect on the proliferation of breast cancer cells（P<0.01）. Cell cycle analysis showed that the proportion of S phase cells in breast cancer cells of the experimental group was decreased（P=0.018） and the proportion of cells in G1 phase increased（P=0.021）. ETOP decreased BMI1 protein expression（P=0.008）and increased ATM protein expression（P<0.01）. Conclusion ETOP can significantly inhibit the proliferation of breast cancer cells， which may be related to the arrest of cell cycle， down-regulate BMI1 protein and increase the expression of ATM protein to induce apoptosis.

[Key words] BMI1；Etoposide；ATM；Breast cancer

乳腺癌是女性最常見的侵襲性腫瘤，發病率呈逐漸遞增趨勢。深入探討細胞信號通路分子對乳腺癌發生過程中的調控作用，尋找有效的分子作用靶點，將為腫瘤的抗癌藥物研發和臨床治療提供有益的思路。多梳蛋白在維持造血干細胞和神經干細胞自我更新潛能方面具有重要作用，某種程度上是由于它能抑制細胞增殖抑制劑方面的表達，包括p16INK4A，p19ARF/p14ARF和E4F13-61-3。INK4A和ARF是重要的腫瘤抑制因子，基于與c-myc的合作被單獨作為一個致癌基因。原癌基因B細胞特異性小鼠白血病病毒插入位點1（B-cell-specific Moloney mufine leuke-mia virus insertion site 1，BMI1）基因是一種重要的細胞原癌基因。BMI1的升高最初是在淋巴瘤中發現的，而且是于預后不良的患者淋巴瘤中發現的，BMI1的過度表達改變了淋巴細胞[4]。BMI1也促進腫瘤的發生，包括多種惡性腫瘤，如非小細胞肺癌[5]、結腸癌[6]、乳腺癌[7]，鼻咽癌[8]。本研究旨在探討抗腫瘤藥物依托泊苷對體外培養的乳腺癌細胞增殖的影響及機制，及其發生DNA損傷時所引起的相關蛋白表達的變化情況，為依托泊苷作用乳腺癌MCF7細胞DNA損傷反應的研究提供相關的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養

人類乳腺癌細胞株MCF7由中國科學院上海生物科學研究所提供，培養基為RPMll640（產自GIBCO公司），含10%滅活胎牛血清和100 U/mL青霉素，培養箱參數設置為37℃、5%CO2濃度。

1.2 主要試劑和儀器

依托泊苷、環磷酰胺均產自于Sigma公司，ATM蛋白、BMI1蛋白免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑（由武漢博士德有限公司提供）；流式細胞儀、HIMAS-1000病理圖文分析系統（FACScan，Beckman公司）。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

取處于對數生長期的MCF7細胞，以100 μL/孔，細胞濃度1×105個/mL，以加入96孔細胞培養板，培養細胞至貼壁后，環磷酰胺組每孔加入100 mg/L環磷酰胺藥液200 μL；實驗組每孔加入100 mg/L依托泊苷藥液200 μL，對照組每孔加入等體積的培養基。在飽和濕度、37℃、5%CO2濃度培養條件下，分別培養24、48、72 h。在終止培養前4 h，每孔加入10 μL MTT染液（10 mg/mL），正常條件繼續培養4 h后，每孔加入100 μL SDS藥液（100 g/L）終止培養，37℃放置過夜，酶標儀檢測波長為570 nm條件下的OD值，計算細胞生長抑制率（IR）[9]。抑制率（%）=（OD值對照組-OD值實驗組）/OD值對照組×100%。

1.4 流式細胞術檢測依托泊苷對MCF7細胞周期和細胞凋亡的影響

取-20℃預冷的70%乙醇固定的細胞樣品，用預冷的PBS洗滌兩次，加PI染液，4℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡比率和細胞周期變化。

1.5 免疫組化法檢測BMI1和ATM蛋白表達變化

取對數生長期的實驗組和對照組細胞，以細胞濃度1×105個/mL涂片，以H2O2藥液（3%）室溫封閉10 min，PBS洗滌，枸櫞酸緩沖液（0.01 mol/L）浸泡，高溫高壓后緩慢冷卻至室溫。具體實驗操作按照“鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法”進行。BMI1和ATM單克隆抗體1：100稀釋，陰性對照以PBS液替代Ⅰ抗。圖像分析用Image-ProPlus軟件進行分析，每組實驗涂片隨機取10個視野檢測細胞BMI1和ATM 蛋白表達陽性的吸光度積分，平均值表示BMI1和ATM 蛋白表達強度，蛋白陽性產物表達越強則吸光度值越大。

1.6 統計學方法

用SPSS18.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞細胞周期和凋亡指數比較

細胞增殖抑制與對照組細胞抑制率（0）相比，依托泊苷實驗組（65.8%）、環磷酰胺組（53.9%）對乳腺癌MCF7細胞具有顯著的增殖抑制作用（P<0.01）。細胞周期變化與對照組相比，實驗組S期的細胞比例顯著降低（P=0.025），G0/G1期的細胞比例顯著升高（P=0.0007）。見表1、圖1。

2.3 細胞BMI1和ATM蛋白表達情況比較

與對照組比較，依托泊苷顯著降低BMI1蛋白表達量（P=0.016），顯著增加ATM蛋白表達量（P<0.01）。見表2、圖2。

3 討論

細胞凋亡與增殖的失衡以及細胞周期紊亂是腫瘤發生的兩個重要機制。一方面通過誘導和促進腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞增殖；另一方面可以調控腫瘤細胞的增殖周期，使腫瘤細胞不能進行正常的細胞分裂，通過研究細胞凋亡和細胞周期獲得治療腫瘤的策略和方法。抗腫瘤藥物依托泊苷（Etoposide Injection，ETOP）具有快速、高效和低毒副作用的特點，已廣泛應用于多種實體腫瘤的治療。BMI-1 基因位于染色體10 p12.2，其mRNA 約為3199 bp，有 10 個外顯子，其序列在人和小鼠之間具有高度同源性[10]。BMI1基因是一種重要的細胞原癌基因，目前還不完全了解BMI1在維持干細胞和促進腫瘤發生的詳細機制，BMI1對表觀遺傳介導的基因表達的影響被廣泛認為是有助于這些過程。BMI1是多梳抑制復合物，其含有E3泛素連接酶，其介導組蛋白H2A在賴氨酸119的泛素化，從而導致多梳復合物1介導的基因沉默。E3連接酶的形成是在BMI1結合到催化亞基RING2時，這種E3泛素連接酶的活性有助于BMI1在干細胞生物和腫瘤中的功能[11-12]。最近證明BMI1在干細胞和腫瘤發生中的作用是在DNA損傷反應（DDR）發生作用。共濟失調-毛細血管擴張突變基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）是與DNA損傷修復密切相關的腫瘤抑制基因[13]。腫瘤通常滅活或減弱檢查點蛋白，包括ATM、CHK1、NBS1和P53。檢查點激活是DDR的一個重要方面，DNA損傷最致命的形式是雙鏈DNA斷裂（DSB），DSB激活ATM，會導致下游目標蛋白的磷酸化和激活，包括γH2AX、CHK2和P53。CHK2和P53的激活導致G2/M期細胞停滯。因此，檢測點的激活對DNA損傷可能會影響存活的DNA損傷細胞能力，檢查點激活的衰減允許癌細胞在DNA損傷的存在下增殖，進一步有助于基因組的不穩定性，導致腫瘤的發生[14-15]。

本實驗結果顯示，BMI1基因過表達會減弱ETOP誘導的ATM活化，過表達的BMI1基因可大幅減弱ETOP誘導G2期到M期發生阻滯。BMI1的下調對ETOP誘導的防止進入有絲分裂變為敏感。BMI1基因至少從一定程度上衰減了G2/M期細胞周期檢查點的活化以及細胞周期的正常阻滯，阻礙了DNA損傷的修復，增加了基因組不穩定性，加劇了腫瘤的進展。本實驗結果表明依托泊苷能夠顯著抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖，能夠有效促進MCF7細胞凋亡，并且依托泊苷誘導的MCF-7乳腺癌細胞凋亡與BMI1基因表達下調和ATM基因表達上調相關。在ETOP處理的MCF7 BMI1細胞中，MCF7中BMI1的大幅下降顯著增強了ETOP誘導的ATM激活的動力學。此實驗結果符合BMI1在促進腫瘤生長中的作用。

總之，BMI1在DNA損傷的存在下有促進癌細胞增殖的作用。這可能會增強基因組不穩定性，并為突變提供癌細胞，從而促進腫瘤的發生。BMI1參與腫瘤的發生及發展多種方式和演進以及與協同基因共同作用的有關機制有待進一步探索。

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（收稿日期：2018-05-06）