鎘脅迫下嗜溫鞘氨醇桿菌降解丁草胺的蛋白質組學研究

林曉燕，牟仁祥，曹趙云，曹珍珍，周 蓉 ，許 萍，陳銘學*

（1.中國水稻研究所農業農村部稻米及制品質量監督檢驗測試中心，杭州 310006；2.農業農村部稻米產品質量安全風險評估實驗室，杭州 310006）

化學農藥和重金屬是兩類最為普遍的土壤環境污染物，在大多數地區往往同時存在[1]。其中，重金屬鎘是土壤中具有潛在危害的重要污染物，其污染程度越來越受到關注；農藥污染中除草劑的污染尤為突出。丁草胺為氯代乙酰胺類除草劑，是目前我國用量最大的三大除草劑之一[2-3]。由于其具有用量大、水溶性高、土壤殘留期長的特點，不僅影響后茬作物的生長，還不可避免地造成生態環境的污染，因此，環境中丁草胺殘留已引起人們的廣泛關注。有研究表明，微生物降解是消除環境中丁草胺的主要方式。目前，關于丁草胺的微生物降解的報道較多，多數研究集中在降解菌的篩選、鑒定、降解特性、降解酶以及丁草胺代謝途徑的研究[4-5]。關于丁草胺降解菌株的蛋白質組學研究較少，重金屬脅迫下的蛋白質組學研究更是鮮見報道[6]。

近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，研究微生物在重金屬及農藥脅迫生理的分子方面的報道越來越多。目前，研究發現重金屬、鹽脅迫、極端高溫或低溫、化學因子及紫外線等多種逆境因子均能影響蛋白質的正常合成，同時能夠抑制（下調）或者促進（上調）以及誘導新蛋白質的合成與表達[7-10]。蛋白質組學能夠從生物體或細胞的整體水平上研究蛋白質的表達和修飾狀態，它比傳統研究微生物脅迫生物體生理生化變化更能夠深入闡明微生物降解污染物及對環境的適應機制，對于揭示微生物對惡劣環境適應能力的規律具有重要的意義。

本研究通過篩選獲得一株能耐受鎘并高效降解丁草胺的菌株，通過雙向電泳技術，比較雙向電泳圖譜差異，并對差異蛋白質進行質譜鑒定及生物信息學分析，從而探討降解菌在鎘脅迫下蛋白表達的差異，以期從細菌的蛋白質組學水平上闡明鎘脅迫下降解菌對丁草胺降解和對鎘耐受的分子機理。

1 材料與方法

1.1 儀器設備及試劑

分光光度儀（UV1800，美譜達儀器公司），純水裝置（摩爾公司），超聲細胞破碎儀（浙江新芝），IPGhor等電聚焦儀（GE Healthcare），DALT-SIX SDS-PAGE電泳儀（GE Healthcare），Ettan-DALT-Six系統水浴循環儀，ImageScanner掃描儀（GE Healthcare），PDquest分析軟件（Bio-Rad），4800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer（ABI）。

Immobiline TM DryStrip pH 3-10 NL，24 cm 和IPG Buffer pH 3-10 NL購自GE公司；Tris-base、Urea、Thiourea、3-[（3-膽酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）、二硫蘇糖醇（DTT）、溴酚藍、十二烷基磺酸鈉（SDS）、碘乙酰胺（IAA）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨（APS）、TEMED、2-D電泳樣品提取緩沖液系列、甘氨酸（Gly）、低熔點瓊脂糖、乙醇、冰醋酸、2-D Equilibration Buffer以及非干擾型蛋白質濃度測定試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；CHCA購自Sigma公司；乙腈和三氟乙酸購自Merck公司；Mass Standards Kit for the 4700 Proteomics Ana?lyzer購自ABI公司。

1.2 供試菌株篩選及培養基配方

1.2.1 供試菌株篩選

5 g農藥廠底層淤泥加入到含100 mg·L-1丁草胺的MM培養基中，37 ℃、150 r·min-1振蕩培養7 d。以1%的接種量轉接到新鮮無機鹽（MM）培養基中，連續轉接3次（轉接培養基中丁草胺的濃度逐漸增大）。取200 μL菌懸液逐級稀釋并涂布在含200 mg·L-1丁草胺的MM平板上。待菌落長出后，挑選單菌落進行劃線純化。純化獲得的菌落依次轉接到50 mL LB液體培養基中，培養到對數生長期時，轉接到50 mL含100 mg·L-1丁草胺的MM培養基中，37 ℃、150 r·min-1振蕩培養3 d，測定丁草胺降解率。在此基礎上，篩選獲得優勢丁草胺降解菌，并通過菌株純培養、提取總DNA、PCR擴增及擴增產物的序列測定，最終實現對篩選菌株的鑒定。

1.2.2 培養基配方

LB培養基：蛋白胨 10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，加水定容到1 L，pH 7.0。固體加入1.5%的瓊脂。分裝滅菌后備用。

無機鹽（MM）培養基：NH3NO31.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.2 g，NaCl 1.0 g，加水定容到1 L，pH 7.0。分裝滅菌后備用。

1.3 實驗設計

將前期分離到的優勢菌株在LB培養基中活化24 h后，分別以2%的接種量接種到50 mL含10 mg·L-1鎘的20 mg·L-1丁草胺的MM培養基及50 mL只含20 mg·L-1丁草胺的MM培養基（對照）中，37℃、150 r·min-1振蕩培養7 d后，離心收集菌體。處理和對照分別設置3個重復。

1.4 蛋白樣品的提取及定量

采用經典的TCA/丙酮法進行樣品中蛋白質的提取。樣品制備方法：取菌體，加入適量蛋白裂解液；80～100 W超聲破碎3 min；4 ℃，2000 r·min-1離心 30 min，去除沉淀；加適量預冷TCA丙酮提取液（10%TCA丙酮溶液），適量的10 mol·L-1DTT使其終濃度為50 mmol·L-1，冰浴下高速勻漿1 min，-20 ℃沉淀過夜；4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min；去除上清，沉淀中加入適當預冷丙酮，輕輕混勻，4℃，12 000 r·min-1離心30 min，重復此步驟1～2次；將沉淀適當晾干（不要特別的干燥），之后沉淀中加入適量蛋白裂解液溶解蛋白。

采用生工生物的非干擾型蛋白質濃度測定試劑盒（SK3071）進行蛋白定量。

1.5 雙向電泳及凝膠圖像分析

委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行蛋白的雙向電泳及凝膠圖像分析。雙向電泳第一相等電聚焦（IEF）選用pH 3-10 NL IPG預制干膠條，蛋白上樣量是150 μg；第二相SDS-PAGE凝膠濃度為12.5%。電泳結束后，凝膠采用AgNO3染色法染色[11]。兩個樣品均設置3次生物學重復，以獲得穩定清晰的電泳圖譜。對脫色后凝膠進行掃描（分辨率≥300 dpi），并使用PDquest 8.0軟件對圖像進行分析。選取清晰、沒有重疊的各個單一蛋白質點作為有效蛋白質點，并將表達量倍數變化＞2或者＜0.5的蛋白質點確定為差異蛋白質點。

1.6 質譜鑒定樣品制備及質譜分析

1.6.1 膠內酶解及Ziptip脫鹽

從凝膠上小心切下存在差異的蛋白質點，進行脫色凍干，加入5 μL 2.5～10 ng·μL-1測序級Trypsin（Pro?mega）溶液[酶與蛋白質量比為1∶（20～100）]，37 ℃反應過夜進行膠內酶解；再用Ziptip（millipore）進行脫鹽。

1.6.2 MALDI-TOF-MS質譜分析

脫鹽后樣品委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行蛋白點MALDI-TOF-MS質譜鑒定。取酶解樣品2 μL，加20%乙腈復溶；取1 μL樣品，點于樣品靶上，讓溶劑自然干燥；取0.5 μL過飽和CHCA基質溶液（溶劑為50%ACN，0.1%TFA）點至對應靶位上并自然干燥；樣品靶經氮氣吹凈后放入儀器進靶槽，進行質譜分析：激光源為355 nm波長的Nd：YAG激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據，PMF質量掃描范圍為800～4000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進行二級質譜（MS/MS）分析，每個樣品點上選擇8個母離子，二級MS/MS激光激發2500次，碰撞能量2 kV，CID關閉。

1.7 蛋白數據庫檢索及生物信息學分析

將獲得的蛋白肽質量指紋圖譜（PMF），輸入到Mascot網站（http：//www.matrixscience.com/）蛋白質數據庫進行檢索，搜索與PMF相匹配的蛋白質，并完成功能查詢，從而實現差異蛋白質點的鑒定。檢索參數設置如下：Database設置為NCBInr；Taxonomy設置為Bacteria；Enzyme設置為Trypsin；Fixed Modification設置為Carbamidomethyl（C）；Variable modifications設置為Acetyl（Protein N-term），Deamidated（NQ），Dioxida?tion（W），Oxidation（M）；Missed cleavages設置為Allow up to one；Peptide mass tolerance設置為±100 mg·L-1；Fragment Mass Tolerance設置為±0.2 Da；Mass values設置為Monoisotopic。MASCOT分析中P＜0.05時，認為蛋白鑒定結果可信。差異蛋白按照2-D電泳圖譜上的差異點編號、蛋白編號、蛋白名稱、所屬物種、等電點、分子量、覆蓋度、得分、肽段匹配數及比值等進行整理，并進行GO功能分析和COG功能分析，從中獲得一些感興趣的重要蛋白。

2 結果與分析

2.1 嗜溫鞘氨醇桿菌的分離鑒定

通過1.2.1中菌株的篩選獲得多株能夠耐受200 mg·L-1丁草胺菌株的純培養，進一步通過丁草胺降解實驗，最終獲得一株丁草胺高效降解菌，編號為15#。通過將15#菌株進行純培養、提取菌株總DNA、16S rDNA的PCR擴增及將擴增產物送到生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定，測定結果（1437 bp）在 NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行BLAST比對，該菌株與革蘭氏陰性桿菌——嗜溫鞘氨醇桿菌屬菌株（Sphingobacterium thalpophilum strain S8SF4）的同源性為99%，最終將篩選到的菌株15#鑒定為嗜溫鞘氨醇桿菌屬菌株（Sphingobacterium thalpophilum sp.），GeneBank 登錄號KJ452209。

2.2 雙向電泳圖譜分析

雙向電泳后的凝膠圖進行圖像采集后，利用PD?Quest 8.0圖像分析軟件對凝膠圖像進行差異比對分析，每個處理的3塊膠圖分別來自于3個獨立的生物學重復試驗。只有那些重復性好（3塊膠上均出現）、蛋白的豐度比即差異倍數＞2或者＜0.5，且經統計檢驗P-value＜0.05的顯著性差異的蛋白點才可以認定為差異表達的蛋白點。通過只加丁草胺和丁草胺-鎘復合處理組之間的差異比對分析，共鑒定到差異表達蛋白點93個（圖1），其中上調蛋白共49個，占差異蛋白總數的52.7%，下調蛋白44個，占差異蛋白總數的47.3%。

2.3 差異蛋白點的質譜鑒定

分析2個處理2-D圖譜共得到差異蛋白質點93個，分別將選出的23個重復性好且最為明顯的差異蛋白質點從凝膠上取下，經胰蛋白酶膠內酶解消化后，利用MALDI-TOF-MS技術對其進行質譜檢測，質譜檢測得到的肽質量指紋圖譜（PMF）數據和二級質譜圖數據結合形成混合譜，再用Mascot（http：//www.matrixscience.com/）軟件對數據庫進行搜索。結果顯示，在23個重復性好且最為明顯的差異蛋白質點中，成功鑒定出15個差異蛋白點，其中上調蛋白8個，占差異蛋白的53.3%，均為鎘脅迫下蛋白表達量明顯增加的蛋白，下調蛋白7個，占差異蛋白的46.7%，均為鎘脅迫下蛋白表達量明顯減少的蛋白，相關信息見表1。對于鑒定到的蛋白，可以通過NCBI數據庫和Uni?Prot數據庫（https：//www.uniprot.org/）進一步查詢，也可以通過 BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比對得到同源或功能相似的蛋白，從而進行后續的生物信息學分析。

2.4 蛋白質相對分子質量（MW）和等電點（pI）的分布

蛋白質相對分子質量（MW）和等電點（pI）含有生物學與病理學中生物標記物和信號分子的重要信息，所以在蛋白質組學研究中蛋白質相對分子質量（MW）和等電點（pI）分布引起廣泛關注。成功鑒定的15個差異蛋白點，其等電點（PI）和分子量變化如圖2所示。等電點在3～4之間沒有蛋白點的分布，等電點在6～7之間的蛋白數目最多（5個），占鑒定到的差異蛋白總量的33.3%；等電點在7～8之間的蛋白數目最少（1個），占總蛋白的6.7%；等電點在4～5與5～6區段的蛋白數目和9～10區段的蛋白數目一致，均為2個，占總蛋白的13.3%。差異蛋白分子量分布差別較大，差異蛋白主要集中在分子量范圍為10 kDa～20 kDa之間的區間，該區間蛋白數量為8個，占鑒定到的差異蛋白總量的53.3%，其他分子量區間差異蛋白數量均很少，其中分子量在30 kDa～40 kDa之間差異蛋白數為2個，占總差異蛋白總數的13.3%，其他區段差異蛋白數均為1個，分別占總差異蛋白的6.7%。

圖1 鎘脅迫下丁草胺降解菌總蛋白的雙向電泳圖譜Figure 1 2-D electrophoresis of protein extracted from butachlor-degradation bacteria under cadmium stress

表1 差異蛋白點的鑒定結果Table 1 Identification of the differential protein points

圖2 差異蛋白等電點和分子量分布Figure 2 Isoelectric point and molecular weight distribution of difference proteins

2.5 差異蛋白的生物信息學分析

Gene Ontology（簡稱GO）已經成為生物信息領域中一個極為重要的方法和工具。本文針對鑒定出的所有蛋白進行了GO功能注釋分析（圖3）。由圖3可以看出，這15個差異表達蛋白參與了4個生物學過程，分別為代謝過程（40%）、生物合成過程（33.3%）、跨膜轉運（13.3%）和蛋白折疊等細胞過程（20%）；細胞組分類別分析發現，這15個差異表達蛋白可以定位到細胞膜、細胞周質間隙、細胞質、細胞外膜等，其中能夠定位到細胞和細胞膜的差異表達蛋白所占比例分別為53.3%和40%，兩者所占的比例之和為93.3%；分子功能類別共分為4個亞類，其中催化和結合亞類所占比例最高，均占差異表達蛋白的40%，轉移活性和電子載體活動分別為13.3%和6.7%。

為了更加深入地了解鑒定到的差異蛋白的生物學功能，我們還對所鑒定到的15個差異表達蛋白通過NCBI網站中的BLAST與COG數據庫進行比對，得到相應的注釋結果，從而進行蛋白相鄰類的聚簇（Cluster of orthologous groups of proteins，簡稱COG）功能分類（圖4）。由圖4可見，15個差異蛋白按功能分為E、M、U、I、C、J、R、P、O和 S共10組，分別為氨基酸轉運和代謝、細胞壁/膜/生物起源、細胞內的販運、分泌和囊泡運輸、脂質轉運和代謝、能量產生和轉換、翻譯、核糖體結構和生物遺傳、通用功能預測、無機離子轉運和代謝、翻譯后修飾、蛋白轉角和伴侶功能以及未知功能。其中，具有能量產生和轉換功能的蛋白最多，占差異表達蛋白總量的20%；其次為脂質轉運和代謝、通用功能預測、翻譯后修飾、蛋白質轉化和伴侶功能的蛋白，分別占差異表達蛋白總量的13.3%；這4類蛋白數量占有COG注釋蛋白數量的60%。

3 討論

圖3 差異蛋白表達的GO分析（包括分子功能、細胞組成和生物過程）Figure 3 The GO enrichment analysis of differences expressed proteins（molecular function；cell component；biological process）

圖4 差異蛋白點的COG注釋圖Figure 4 COG annotation diagram of the differential protein points

與傳統的研究微生物脅迫的生理生化變化相比，蛋白質組學從生物體或者細胞的整體水平上研究蛋白質在脅迫情況下的表達和修飾狀態，能夠從更深層次揭示微生物對環境的適應機制，具有重要的理論意義。本文采用雙向電泳這一經典技術研究了鎘脅迫下丁草胺降解菌降解丁草胺的蛋白質組學研究。通過前期的篩選，我們獲得了一株能夠高效降解丁草胺的嗜溫鞘氨醇桿菌菌株（Sphingobacterium thalpophi?lum sp.），該菌在丁草胺降解試驗中表現優異（結果未在本文列出）。通過只加丁草胺處理和丁草胺-鎘復合處理組之間的2D電泳圖譜進行差異比對分析，我們共鑒定到差異表達蛋白點93個（圖1），其中上調蛋白共49個，均是在鎘脅迫下通過誘導表達從而導致蛋白含量增加；93個差異蛋白點中，鑒定到的下調蛋白共44個，均在只加丁草胺處理的2D電泳膠圖上較為明顯，說明在鎘的脅迫下這些蛋白的表達受到一定程度的抑制。為了進一步明確差異蛋白的性質，對差異蛋白進行了質譜分析。由表2也可以看出，丁草胺單獨處理及丁草胺-鎘復合處理的樣品經質譜鑒定到的差異蛋白表達水平有上調也有下調，其中8個蛋白在丁草胺-鎘復合處理后的菌株中表現上調，7個蛋白在加鎘處理后的菌株中表達量下降。但是鑒定到的這15個蛋白不論是表達量增加還是減少，在鎘脅迫下依然能夠顯著表達，說明這些差異蛋白同時也是鎘耐受蛋白。這與Silver[12]所報道的細菌中存在多種抗金屬的基因，當受到外界重金屬脅迫時，能夠編碼對金屬產生耐性的蛋白的結論相吻合。

本文分別對鑒定到的15個差異蛋白分別進行了GO功能注釋分析和COG功能分類。本文中鑒定到的位于細胞質中差異點編號為30和5017的co-chap?eroneGroES（蛋白編號為A0A0M7GIQ5和A0A255QDH8）以及差異點編號為5016的無機離子轉運蛋白copper chaperone PCu（A）C蛋白分別屬于分子伴侶蛋白的一種，在鎘脅迫下其表達量明顯上調（分別是只加丁草胺處理的蛋白表達量的9.28、8.33倍和11.62倍）。其中，兩種co-chaperone GroES蛋白能夠在Mg-ATP的作用下輔助位于質體的伴侶蛋白Cpn60與底物的結合并抑制ATP酶活性。Copper chaperone PCu（A）C蛋白經功能分析后發現，該蛋白主要參與無機離子的轉運與代謝，因此，加鎘處理菌株中該蛋白表達上調。有研究表明，分子伴侶蛋白往往具有多種功能，如脅迫保護防止交聯聚沉，轉運，調節轉錄和復制，組裝細胞骨架，通常是在應激反應情況下產生的。近年來的研究表明在正常生長條件下，這類蛋白仍少量存在，對蛋白跨膜運輸，結構折疊也有重要作用。當受到重金屬脅迫時，該類蛋白表達量會增加，過量表達水平與脅迫程度呈正相關[13]。微生物在長期的進化過程中，形成了自己獨特的信號轉導系統以響應外界環境的脅迫，從而產生了一些響應脅迫的蛋白質。在鑒定到的所有上調蛋白中，相對于單獨丁草胺處理，加鎘處理后上調幅度最大的為光合系統Ⅰ葉綠體脫輔基蛋白PSⅠP700（差異點編號為9012，蛋 白 編 號 為 A0A0M7HIV1，差 異 倍 數 為149.08），GO功能注釋分析發現該蛋白為一種外膜蛋白，分子功能為氧化脅迫的信號肽，結合COG功能分類分析推測該蛋白在鎘由細胞外向細胞內轉運過程中起了關鍵作用，是菌株響應鎘脅迫的敏感蛋白，與菌株抗鎘密切相關。在鑒定到的上調蛋白中，還有一個在鎘脅迫后蛋白表達量顯著增加，且增加程度僅次于光合系統Ⅰ葉綠體脫輔基蛋白PSⅠP700的蛋白（蛋白編號為A0A0D6IIE6，差異點編號為9011），該蛋白為功能未知蛋白，在鎘存在時其表達水平是單一丁草胺處理菌株中的77.67倍，推測鎘的存在刺激了該蛋白的表達，說明該蛋白與菌株抗鎘之間存在著某種密切聯系，該蛋白同樣作為鎘脅迫的敏感蛋白，也是值得我們深入研究的蛋白之一。

差異點編號為8515的氨基酸轉運蛋白（蛋白編號為A0A0D6IPR6）主要參與降解菌株對丁草胺的代謝，鎘脅迫情況下該蛋白的表達水平為下調，說明降解菌株對丁草胺的代謝受到一定程度的抑制。該結論與王金花[14]的推測相一致。GMC氧化還原酶廣泛存在于原核生物和真核生物中，主要作用是參與碳水化合物的代謝。差異點編號為7807的GMC氧化還原酶蛋白（蛋白編號為A0A0D6IPR6）在處理中也表現為下調，同樣說明鎘脅迫下鈣蛋白的表達受到一定程度的抑制。

另外，在GO分析和COG分析中，我們還發現，所有參與代謝的蛋白中大多數蛋白在鎘脅迫下均表現為下調表達，只有蛋白編號為D4FMF4的蛋白為嗜熱家族（PfpI）蛋白（差一點編號為108）表現為上調，說明該蛋白能夠在鎘脅迫下抗鎘的同時參與丁草胺的代謝。通過查閱文獻，我們發現該類蛋白具有多種生物學功能，最典型的就是抗氧化應激功能，隨著氧化應激的積累，該蛋白對氧化應激的敏感性隨之增高，從而蛋白表達水平上調。關于其抗氧化的機制，相關研究表明有以下幾種方式：自身構型改變、分子伴侶作用、通過保護線粒體功能抵抗氧化應激以及調控抗氧化應激相關基因等[15]。該蛋白以及其抗氧化機制也是一個非常值得深入研究的課題。

4 結論

（1）篩選到一株鎘脅迫下丁草胺高效降解菌株15#，經16S rDNA基因測序及序列比對分析，該菌株鑒定為革蘭氏陰性桿菌——嗜溫鞘氨醇桿菌（Sphin?gobacterium thalpophilum sp.），GeneBank登錄號KJ452209。

（2）通過不同處理間的雙向電泳圖譜差異比對分析，共鑒定到差異表達蛋白點93個，其中上調蛋白49個，下調蛋白44個。在重復性好且差異最為明顯的23個蛋白質點中，利用MALDI-TOF-MS技術成功鑒定出15個差異蛋白，其中8個為上調蛋白，7個為下調蛋白，且這些蛋白的等電點主要分布在6～7之間，分子量范圍主要集中在10 kDa～20 kDa之間的區間。

（3）鑒定到的15個蛋白在鎘處理下均能顯著表達，說明這些差異蛋白同時也是鎘耐受蛋白。這15個蛋白總共分為兩大類，一類為參與丁草胺代謝的蛋白，另一類為響應鎘脅迫敏感蛋白及在抗鎘情況下參與丁草胺代謝的蛋白。

（4）分析發現，鎘脅迫下上調幅度最大的兩個敏感蛋白（蛋白編號分別為A0A0M7HIV1和A0A0D6IIE6）以及抗鎘脅迫的同時參與丁草胺代謝的蛋白（蛋白編號為D4FMF4），均為今后延續性研究中需要重點研究的三個蛋白。