基于Biolog—ECO技術的淮南采煤沉陷區水體微生物代謝多樣性研究

柳炳俊

摘 要：如何治理與利用高潛水位采煤沉陷區水資源，一直是困擾區域生態文明構建與經濟協調發展的1個重要難題。該研究以我國東部典型采煤沉陷區——淮南礦區為例，通過Biolog-ECO平板技術分析3個不同區域9個沉陷水體微生物的碳代謝多樣性特征。結果表明，3個區域水體中異養菌數量、微生物代謝活性和香濃多樣性指數均為潘集區>八公山區>鳳臺區。

關鍵詞：高潛水位；采煤沉陷區；Biolog-ECO平板；微生物代謝活性；多樣性指數

中圖分類號 X52 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）19-0101-04

The Study on Metabolic Diversity of Water Microbial Communities in Huainan Coal Mining Subsidence Area based on Biolog-ECO Plates

LiuBingjun

（Anhui University，Hefei 23000，China；National Engineering Research Center for Coal Gas，Huainan 232001，China）

Abstract：How to manage and utilize water resources in coal mining subsidence areas with high phreatic level has always been an important problem that plagues the coordinated development of regional ecological and economic civilization. As Huainan mining area was the typical coal mining subsidence area in eastern China，carbon metabolism diversity of water microbes in nine subsidence areas in three different regions was investigated by Biolog-ECO plate technique. The number of heterotrophic bacteria，microbial metabolic activity and Shannon diversity index of the three regions were showed Panji >Bagongshan >Fengtai. This study aims to provide theoretical support for the rational planning and utilization of water resources in typical subsidence areas.

Keywords：High phreatic level；Coal mining subsidence area；Biolog-ECO plates；Microbial metabolic activity；Shannon diversity index

煤炭在我國的能源發展中一直占有極其重要的戰略地位，在我國能源消費占比超過60%，其中2016年為62.3%。淮南礦區作為中國新型能源基地，是全國13個億噸級煤炭基地之一，煤炭探明儲量約為153億t，開采工藝采用多煤層綜合機械化采煤。這種開采方式必然引發地表沉陷，研究表明淮南采煤沉陷系數約為0.7[1]。淮南周邊地表水系發達，有淮河干流與茨淮新河、潁河、西淝河、架河、泥河等眾多支流。此外，淮南地區地下潛水位高，沉陷超過1m就常年積水，截至2016年底，淮南采煤沉陷區面積超過2.41萬hm2，常年積水面積達0.90萬hm2。如此連片的大面積水資源，如能將沉陷區環境治理與生態功能區建設結合起來，加以合理規劃利用，勢必對區域經濟發展、生態環境治理，提供強大推助力。

Biolog方法是由美國的BIOLOG公司于1989年研制成功，最初用于微生物菌種鑒定的一種便捷的方法。它是根據微生物對碳源的利用能力差異，來描述群落中微生物的動態變化。其原理是發生在微生物利用碳源過程中產生的自由電子與四唑鹽染料發生的還原顯色反應，其顏色的深淺可以反映微生物對不同碳源的利用程度[2]。該方法借助于96孔微孔板，如革蘭氏陽性板（GP）革蘭氏陰性板（GN）和生態板（ECO）等來實現。

Biolog-ECO微平板法通過采用底物誘導下的代謝響應模式來測算水體微生物群落代謝功能多樣性，并用來描述不同區域微生物群落功能的差異[3]，吸光值平均變化率（AWCD）用于評價水體微生物群落對碳源利用的整體情況及代謝活性，Shannon多樣指數用于評估微生物群落中物種的豐富度。因此Biolog-ECO平板技術可用于水體“原位”微生物群落代謝和功能多樣性的研究（Garland and Mills[4]，1991；鄭華等[5]，2004；陳喜蓉等[6]，2017）。本研究首次采用Biolog-ECO平板技術對我國典型采煤沉陷區水體微生物群落代謝功能進行多樣性調查分析，其研究成果將為沉陷區生態修復，水資源利用方向，打造淮南水域生態功能區提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 采樣布點 淮南采煤沉陷區根據沉陷類型主要劃分為3大區域：鳳臺區（非穩沉區）、八公山區（穩沉區）和潘集區（半穩沉區）。每個區選擇3個有代表的采煤沉陷水域采集水樣，每個沉陷水域用采水器（1L）采集3個不同點位，混勻后置于1L無菌塑料瓶中，冰袋保存運回實驗室，24h內檢測結束，水質數據具體詳見表1。

1.2 實驗儀器 哈希溶解氧儀5500、哈希DR6000 紫外分光光度計、3洋MKR-352生化恒溫培養箱、3洋MLS-375L-PC高壓蒸汽滅菌器、Biolog Gen Ⅲ MicroStationTM 自動微生物鑒定系統。

1.3 平板菌落計數 異養菌數量的測定采用MPN法，培養基為CM232水瓊脂培養基（北京陸橋技術有限責任公司），將涂布好的平行平板在28℃下培養48h，對單克隆總數在30～300的平板進行有效計數，并以計數平板上的單克隆總數作為0.1mL稀釋樣品中的異養菌總數。

1.4 Biolog-ECO法 本實驗采用31種碳源底物的Biolog-ECO板（Biolog Inc. Hayward，CA，USA）分析水體微生物群落的碳代謝特征，即代謝功能多樣性。根據底物的化學官能團及微生物代謝途徑可將31種碳源劃分為6大類[7]，其中聚合物4種、碳水化合物10種、羧酸類7種、氨基酸類6種、酚類2種、胺類2種。實驗方法參照文獻[8]的方法并略作修改，具體操作步驟如下：將樣品混勻震蕩靜置10min，取5mL原水樣置于95mL無菌生理鹽水稀釋至10-1梯度，將稀釋后的水樣置于無菌加樣槽中，用8道移液器將水樣加入平板的微孔中，每孔150μL。每塊板設3個重復。微板加蓋，28℃恒溫培養7d，并于0、24、48、72、96、120、144、168h的時間點在590nm和750nm下測吸光度值，其中數值小于0.06時按0處理。

1.5 微生物代謝活性指標的計算 以顏色平均變化率（Average Well Color Development，AWCD）評判微生物群落對碳源的利用率，并以此指示群落的代謝活性。計算公式[9]如下：

AWCD=Σ[（Ci-R）590-（Ci-R）750]/n

式中：Ci為所測定的第i個碳源孔的光密度值；R為對照孔的光密度值；n為培養基碳源種類數。

參考閆法軍等[10]的方法，采用Biolog-ECO微平板培養72h的數據進行分析，以Shannon指數計算群落代謝功能多樣性，其算式為：H=-ΣPilnPi。式中：Pi=ni/N；ni為第i種碳源孔的實際光密度值；N為樣品中所有碳源孔實際光密度值的總和。

1.6 數據處理方法 采用SPSS17.0單因子方差分析（ one-way ANOVA）確定不同沉陷水體微生物群落碳代謝特征是否有顯著差異（α=0.05）。對不同微生物群落指標與水質的相關性分析采用Pearson分析法，通過其相關系數進行判定，數據的顯著性水平設為p<0.05和p<0.01。

2 結果與分析

2.1 不同沉陷水體異養菌數量變化 圖1反映出不同沉陷水體異養菌數量變化。鳳臺區水域異養菌數量顯著低于其他2區（p<0.05），細菌數量變化在（6.2±0.48）×103～（7.0±0.15）×103cfu/mL。八公山區水域異養菌數量變化在（7.0±0.74）×103～（9.6±0.38）×103cfu/mL。潘集區異養菌數量顯著高于上2個區域，且3個水域之間差異明顯（p<0.05）。

2.2 不同沉陷水體微生物平均吸光值（AWCD）變化特征 水體微生物AWCD隨時間的變化可以用來表示群落的代謝平均活性，能直觀的體現微生物群落反應速度和最終達到的程度[10]。9個水體（潘集區、八公山區、鳳臺區）AWCD值隨培養時間動態變化曲線見圖1，從圖1可以看出，所有水體微生物總體變化趨勢為：12h內水體微生物碳代謝活性較低，24h以后隨著培養時間延長微生物活性逐步增加，至144h后微生物活性達到最高后趨于平穩。水體微生物AWCD的動態變化范圍為（0.2911±0.004）～（1.1529±0.041），其中潘一礦沉陷區AWCD最高為1.1529±0.041，張北礦最低為0.29110±0.004。對比不同水體微生物活性強弱可以明顯看出潘一礦沉陷區AWCD明顯高于其他區域（p<0.05）；而張北礦沉陷區最低，顧橋礦，顧北礦顯著高于張北礦沉陷區（p<0.05）；其他5個沉陷區差異不顯著（p>0.05）。

2.3 不同沉陷水體微生物群落的代謝功能多樣性變化

根據Biolog-ECO板培養72h的AWCD值計算Shannon-Wiener指數，結果見圖2。菌群多樣性變化特征與碳代謝活性AWCD相似，水體微生物多樣性最低的沉陷區依次是張北礦、顧橋礦、顧北礦沉陷區，分別為2.34±0.05、2.94±0.01、3.24±0.01，而潘一礦沉陷區群落多樣性最高為3.64±0.003，其他5個區域差異不顯著（p<0.05）。

2.4 不同沉陷水體微生物群落代謝活性和多樣性與水質的關系 如表2所示，異養菌數量與溶解氧（DO）成負相關關系（p<0.01），與生物需氧量（BOD5）、化學需氧量（CODcr）、總磷（TP）成正相關關系。水體微生物群落代謝活性與水中溶解氧（DO）在p<0.01水平上成負相關關系r=-0.880，與生物需氧量（BOD5）在p<0.01水平成正相關關系，r=0.883，與化學需氧量（CODcr）在p<0.05水平上成正相關關系，r=0.690，與水體PH、總氮（TN）、總磷（TP）相關關系不顯著。水體微生物多樣性與水中溶解氧（DO）成負相關關系（p<0.05），r=-0.744，與生物需氧量（BOD5）成正相關關系（p<0.05），r=0.690，與CODcr、TP、TN顯著關系較弱。

3 討論

本研究結果顯示，水體中微生物群落與水質具有密切關系。之前許多研究者從水中異養細菌數量、群落中優勢菌組成情況進行分析[11-12]，本研究以微生物群落代謝活性、代謝功能多樣性與不同種類的水質主要指標為切入點，通過系統的對比、分析，更全面地闡明了彼此的相關性。

潘一礦沉陷區水體微生物碳代謝活性和群落多樣性指數都高于其他沉陷水域，這一現象通過上述數據與水質關系分析得到了解釋：潘一礦沉陷區受生活污水匯入和圍網養殖等因素影響，水中有機物質較高，測得水域生物需氧量（BOD5）與化學需氧量（CODcr）均較其他沉陷區高，微生物代謝活性和多樣性也明顯高于其他水體。夏耕等[13]研究表明溶解氧在6.0mg/L以上、pH值成弱堿性的水質條件下，草魚和大口黑能較好生長，且養殖期間病害較低。潘一礦沉陷水域異養菌數量、生物需氧量（BOD5）與化學需氧量（CODcr）等水質指標處于養殖用水所需指標正常范圍內。潘集采煤沉陷區可根據水質條件，利用微生態菌劑和浮游藻類等手段優化水環境，發展綠色水產養殖業。

不同沉陷區之間比較，以張北礦、顧橋礦、顧北礦為代表的鳳臺區水域微生物碳代謝活性和群落多樣性指數較其他區域低，通過實驗分析和現場調查發現，鳳臺區沉陷水體農業點源、面源污染較少，又遠離生活區，水體有機物較少致使微生物數量和多樣性較其他區域低。比較有趣的發現是溶解氧（DO）與微生物碳代謝活性和群落多樣性成負相關關系，這與之前曹煜成、楊鶯鶯[14]等的研究結果稍有不同，曹煜成等研究結果表明溶解氧與微生物群里關系相關系不大。這很可能是因為研究的水體環境不同造成的，前者研究的是羅非魚混養池塘水體微生物群落代謝活性的動態變化及其與水質的關系，而本研究對采煤沉陷區大水域作為研究對象，沉陷水體為開放水域、與外部河流相通。本研究發現溶解氧（DO）與微生物碳代謝活性和群落多樣性成負相關關系，可以從側面推斷淮南采煤沉陷區水體中微生物厭氧菌或者兼性厭氧菌占有很大的比例。

4 結論與展望

本研究首次通過Biolog-ECO平板技術研究我國典型采煤沉陷水域微生物碳代謝活性和群落多樣性特征。研究結果顯示，不同沉陷水體微生物代謝活性和多樣性存在差異，具體表現以潘一礦、潘一東礦和潘3礦為代表的潘集采煤沉陷區微生物代謝活性和多樣性最高，以張北礦、顧橋礦和顧北礦為代表的鳳臺采煤沉陷區最低，八公山采煤沉陷區居中。水體微生物代謝活性和菌群多樣性與部分水質有顯著相關關系，其中與BOD5和CODcr成正相關關系，與DO成負相關關系。

本研究結果能夠為采煤沉陷水體治理與利用提供數據支持，筆者認為利用微生物降解水體中過多的有機物、重金屬和代謝產物等，能夠達到凈化水質和水環境原位修復的效果，能夠減少人為擾動對沉陷水域環境的負面影響。后期在建立以沉陷水體水質凈化和水環境原位修復的過程中，一方面潘集區水域由于水體較其他區域肥，可以發展綠色水產養殖業；而鳳臺區沉陷水體水質條件較好，可以作為水源地加以保護；八公山區可以依托當地旅游業，開發生態濕地公園。另一方面，從水體微生態角度，還應注重篩選具有不同代謝特征的高效菌種或微生態制劑，優化水體微生物群落結構，利用不同種類微生物誘導微生物群落對環境中的碳、氮、磷、硫等營養物質進行降解與轉化，強化微生物群落降解效率與性能，并保持其代謝活性的穩定化。因此，高效微生物的篩選與安全性評價、微生物群落代謝的特異性誘導、微生物數量和群落活性穩態化的精準調控等將是今后沉降水域微生物的研究方向。

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（責編：張宏民）