組蛋白H3K4甲基轉移酶KMT2D研究進展

閻晗，于明航 綜 述，尹潔，王璽 審 校

（天津醫科大學細胞生物學系，天津 300070）

表觀遺傳學在調控基因表達上扮演重要角色。組蛋白H3K4的甲基化是細胞修飾啟動子和增強子的1種方法。組蛋白H3K4的三甲基化（H3K4me3）主要聚集在轉錄活躍的啟動子區域，而一/二甲基化（H3K4me1，H3K4me2）則主要集中在增強子區域[1]。酵母菌中，Set1復合物中的催化亞基SET1，具有組蛋白H3K4的甲基轉移酶活性，參與組蛋白H3K4的 me1，me2，me3 的修飾[2-3]。在果蠅中，dSet1、Trx和Trr是已知的3種Set1樣組蛋白H3K4甲基轉移酶。哺乳動物體內存在6種Set1樣H3K4甲基轉移酶，分別是 KMT2A（MLL1）、KMT2B（MLL2）、KMT2C（MLL3）、KMT2D（MLL4、ALR、MLL2）、KMT2F（SET1A）和KMT2G（SET1B）。KMT2D對于基因調控起到重要作用，其突變導致多種發育疾病和腫瘤的發生。本文對哺乳動物中最主要的H3K4單甲基化轉移酶-KMT2D進行探討，以期為探究疾病治療的新方法提供思路。

1KMT2D蛋白

如圖1所示，KMT2D蛋白的結構包括N-末端的兩組植物同源結構域（PHD）（每組包含3個PHD），C-末端的SET結構域負責組蛋白H3K4的甲基化[3]。體外實驗表明，第2組PHD（PHD4-6）識別核小體的H4尾巴，對于KMT2D-催化組蛋白甲基化起決定作用[4]。SET結構域的突變和缺失導致KMT2D蛋白的不穩定，表明SET區域不僅具有酶催化活性，并且對于維持蛋白穩定性至關重要[5-6]。在SET結構域上游是一個PHD區域和富含苯丙氨酸和絡氨酸（FY-rich）N/C-末端（FYRN 和 FYRC）區域。此外，還包含一個高速泳動族非組蛋白（HMG-1）和九個核受體相互作用基序（LXXLLs）[7]。體外實驗表明，氨基酸Y5426和Y5512對于人KMT2D的酶活性起決定性作用[6]。人胚胎干細胞（ESCs）中KMT2D的Y5426突變后，KMT2D會失去酶活性，但并不影響KMT2D蛋白的穩定性[5]。

圖1 人類組蛋白H3K4甲基轉移酶KMT2D蛋白

2KYM2D蛋白復合物

KMT2D是首次在Hela細胞核提取物一個蛋白復合體中分離純化出來的。對Pax反式激活結構域作用蛋白（PTIP，一種與組蛋白H3K4甲基轉移酶類相關的蛋白）相互作用蛋白的親和純化研究表明，PTIP除了與DNA損傷應答有關的蛋白質相互作用外，還與 ASH2L、RbBP5、WDR5、DPY30、NCOA6、UTX（KDM6A）、PA1、KMT2C和KMT2D有關聯[8]（圖2）。純化的KMT2C和KMT2D表現出強H3K4甲基轉移酶活性[9]。WDR5、RbBP5、ASH2L 和 DPY30 形成4個亞基的子復合物WRAD，此復合物對于所有哺乳動物中Set樣組蛋白甲基轉移酶復合物的酶活性起關鍵作用[10]。WDR5直接與KMT2C和KMT2D的C-末端FYRN/FYRC區域結合[8]。PTIP和PA1是KMT2C和KMT2D復合物中獨特的亞基，除此之外還包含一個特殊的亞基UTX，它介導組蛋白H3K27的去甲基化[11]。缺失KMT2D將導致細胞中KMT2D復合物的解體和UTX的不穩定。

圖2 KMT2D蛋白復合物

3 KMT2D主要催化組蛋白H3K4一甲基化

增強子是順式作用元件，常與細胞型特異轉錄因子（TFs）結合，在真核細胞中對于特異基因的表達至關重要[12]。研究表明，KMT2D主要是通過其酶活性對細胞增強子區域進行H3K4—甲基化修飾，與KMT2C有功能冗余[13]。Lee等[13]運用ChIP-Seq研究，表明KMT2D在不同的細胞類型和分化水平，選擇性的結合在特異增強子區域。在細胞分化期間，轉錄因子（TFs）募集KMT2D與特異增強子結合。在未分化的KMT2C敲除細胞中，KMT2D基因缺失引起H3K4me1/2和H3K27乙酰化水平降低，轉錄輔助因子和RNA聚合酶II結合增強子的能力減弱，導致基因表達和細胞分化受阻。此外，KMT2D還識別超級增強子。在細胞分化過程中KMT2C和KMT2D對于超級增強子的形成是必須的[14]。

KMT2C和KMT2D對于H3K27乙酰轉移酶CREB-結合蛋白（CBP）和/或p300與增強子區域的結合、激活增強子、增強子-啟動子成環、活化啟動子，這一系列生物學過程是必須的[14-15]。由于乙酰化和甲基化往往是互相排斥的，可以推論，KMT2C和KMT2D復合物中的UTX亞基催化組蛋白脫甲基形成一個H3K27位點后，CBP和/或 p300對H3K27位點乙酰化（H3K27ac）。但是，研究表明UTX的H3K27脫甲基酶活性對于增強子活化和細胞特異基因表達是非必須的，其功能主要是與KMT2C和KMT2D形成復合物后作用于增強子[16]。

H3K4me1、H3K27ac是活化的增強子的標志[1]，基于此論斷，提出KMT2D與增強子作用的三步式模型，如圖3所示，過氧化物酶體增殖物活化受體-γ（Ppar-γ）的增強子活化過程。（1）轉錄因子，如C/EBPβ，與增強子區域結合。（2）C/EBPβ 和特異轉錄因子，如PPARγ和C/EBPα，共同募集KMT2D與增強子區域結合，催化H3K4—甲基化。(3）KMT2D促進CBP和/或p300的結合，活化增強子區域，使其標記乙酰化H3K27。轉錄因子和乙酰化的H3K27可募集bromodomain結構域結合蛋白4（BRD4），進而招募RNA聚合酶II，從而活化特異基因表達。

圖3 KMT2D調控Ppar-γ增強子，誘導特異基因表達的三步式模型

4 KMT2D在細胞發育、分化、新陳代謝和腫瘤抑制方面的作用

KMT2D在哺乳動物細胞中參與許多生命活動的進程，如發育、分化、新陳代謝和腫瘤抑制。其主要功能是通過激活增強子從而調控基因的表達。

4.1 發育和分化Kmt2d基因敲除的小鼠呈現出E9.5（胚胎第9.5 d）胚胎致死[13]。運用Myf5啟動子驅動的Cre轉基因小鼠，特異敲除肌肉和褐色脂肪前體細胞中的Kmt2d基因，導致褐色脂肪組織和肌肉質量的顯著下降，說明KMT2D在肌肉和脂肪組織發育中起重要作用[13]。特異敲除心臟前體細胞和心肌細胞中的Kmt2d基因導致嚴重的心臟缺陷和胚胎致死[17]。心臟發育進程中，KMT2D介導的H3K4me1/2在特異基因表達中有重要作用[17]。在B細胞發育過程中，KMT2D也扮演重要角色[18]。此外，KMT2D調控神經元和成骨細胞分化過程中特異基因的表達[4，19]。研究發現，KMT2D對于細胞命運轉變有重要作用，但對于胚胎干細胞和成體細胞的維持是非必須的[15]。

4.2 新陳代謝 在肝臟中，KMT2D與KMT2C也存在功能冗余，二者在多種新陳代謝過程中發揮顯著作用。Kmt2d+/-雜合小鼠，表現出糖耐受性、胰島素敏感性的增強，其血清膽汁酸水平升高[20]。Kim等[20]運用RNA-Seq分析發現，KMT2D和KMT2C對于肝臟生理節奏的表觀遺傳調控至關重要，作為生理節律轉錄因子視黃酸-相關孤兒核受體（ROR）-α和-γ的轉錄輔助因子發揮重要作用。該課題組實驗表明Kmt2d+/-小鼠表現出對高脂飲食誘導的肝脂肪變性的抵抗性[21]。

4.3 腫瘤抑制 大量研究表明，KMT2C和KMT2D具有腫瘤抑制作用。相關實驗表明，NCOA6和KMT2C或KMT2D作為抑癌基因p53轉錄輔助因子，是在DNA損傷藥物阿霉素作用細胞后，內源性p53基因表達所必須的[22]。小鼠體內研究表明，KMT2C和KMT2D在急性髓系白血病、濾泡性淋巴瘤和彌漫大B細胞淋巴瘤中起到抑制腫瘤的作用[23-24]。Chen 等[23]運用 RNAi和 CRISPR/Cas9 技術，研究發現KMT2C基因表達水平低于大約50%會誘發白血病。Zhang等[24]在Kmt2d敲除的小鼠中，過表達致癌基因Bcl2，導致生發中心來源的B細胞淋巴瘤的發生率上升。Ortega-Molina等[18]研究表明，敲除小鼠B細胞中的Kmt2d，會影響抑癌基因TNFAIP3,SOCS3和TNFRSF14的表達，并進一步誘發淋巴瘤。

另一方面，有研究發現，在乳腺癌和結腸癌中，KMT2D缺失會降低癌細胞增殖率[25-26]。此外，在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞中，KMT2D活性升高會促進染色質解螺旋招募轉錄因子，如雌激素受體（ER）。在 MCF7細胞中，AKT結合并磷酸化KMT2D，使其甲基轉移酶活性和ERα活性降低[27]。研究發現，加入PI3K抑制劑使AKT失活，導致雌激素受體目的基因表達上調，會降低乳腺癌藥物的治療效果[27]。研究表明KMT2D在不同細胞類型中具有多種功能，這可能取決于基因活化過程中KMT2D招募的特殊的轉錄因子結合基因組的特異位點。

5 KMT2D突變導致發育疾病和腫瘤發生

已證明KMT2D基因突變是引發Kabuki綜合征最常見的原因。序列分析結果顯示，Kabuki綜合征患者中，KMT2D基因突變率高達56%～75%[28]。此外，先天性心臟病患者表現出大量的調節H3K4甲基化水平的基因的突變，其中包括KMT2D基因[29]。Ang等[17]發現，敲除小鼠Kmt2d基因將導致心臟發育缺陷。

KMT2D基因作為最常見的突變基因之一出現在多種癌癥中[30]。研究發現，在惡性腫瘤中，KMT2D基因的SET和PHD區域的突變，其中37%是移碼突變，60%是無義突變[7]。KMT2D基因突變導致多種組織發生癌變[7]，如成神經管細胞瘤[31]、嗜鉻細胞瘤[32]、非霍奇金淋巴瘤[33]、彌漫性大B細胞淋巴瘤[34]，食管鱗狀細胞癌[35]、胰腺癌[36]、前列腺癌[37]。經過對KMT2D分子在疾病發生發展中作用的不斷研究，已研發出其相應抑制劑，這可能為疾病的治療提供新的手段[7]。