基于g-C3N4-CeO2復合材料的電化學生物傳感器

李曉琴， 劉雅杰， 曹秀芝， 王 娟, 姚 慧

(沈陽化工大學 應用化學學院， 遼寧 沈陽 110142)

過氧化氫(H2O2)不僅是酶反應的產物，還是許多工業生產的原材料,在工業、環保、食品、制藥、臨床和許多其他領域中有廣泛的應用[1-2].但是過量的H2O2可能會損壞DNA或蛋白質導致一些疾病的產生，如癌癥、心血管疾病和帕金森氏病等[3-4].因此對H2O2進行快速、準確的檢測具有十分重要的意義.目前可用于對H2O2的檢測方法有化學發光法、熒光法和電化學方法等[5-8].其中因方法簡單、靈敏度高、成本低和選擇性好等優勢使電化學方法受到廣泛關注[9-10].

石墨氮化碳(g-C3N4)是由碳、氮元素以sp2雜化形成的三嗪環(C3N3環)或3-s-三嗪環(C6N7環)構成，具有類石墨結構的層狀化合物.因其具有高的光催化活性已成為在光催化分解水制氫[11-13]，光催化降解有機污染物[14-16]和傳感器[17-19]等領域研究的熱點.除了具有光催化活性，g-C3N4還具有良好的生物相容性，低毒，高溫穩定性，化學穩定性強，制備簡單以及價格低廉等優點，這使其在電化學傳感器方面的應用成為可能.但g-C3N4的缺點是導電性差，這也是g-C3N4材料在電化學傳感器方面報道較少的原因.近年來，唐躍[20]等制備出了石墨相氮化碳，將其修飾到玻碳電極表面用于檢測重金屬Cd2+.黃素珍[21]等制備了基于g-C3N4材料用于硝基苯檢測的電化學傳感器.為了改善g-C3N4的導電性，以g-C3N4作為基體材料摻雜傳導電子的元素或化合物從而提高基體材料電子的傳遞性被廣泛研究.研究發現在g-C3N4中摻雜CeO2可形成異質結結構，這種結構有利于電子的傳遞從而為本課題的研究提供了依據[22].

CeO2是一種應用很廣泛的稀土半導體材料，具有獨特的螢石晶體結構和豐富的氧空位缺陷.因其能在Ce4+/Ce3+兩種價態之間相互轉化，從而具有良好的氧化還原能力[23].CeO2已被廣泛應用于電化學、光學、催化劑、氣體傳感器等領域[24].近年的研究表明，納米CeO2性質穩定，比表面積高，具有良好的生物相容性，這使其在電化學傳感器方面的應用成為可能[25].本文成功合成了g-C3N4-CeO2復合材料，為了近一步提高材料的導電性在材料表面電化學聚合金，將其應用于H2O2生物傳感器的構建.用循環伏安法和計時電流法研究該傳感器對H2O2的電化學行，并對實驗條件進行優化.結果表明該生物傳感器有較低的檢出限、較寬的線性范圍和較強的抗干擾能力，可以應用于對H2O2的檢測，在實際水樣的測定中得到較滿意的結果.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電化學工作站，CHI 660C 型，上海辰華儀器有限公司；標準三電極體系：工作電極為修飾后的玻碳電極(GCE)，對電極為鉑絲電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)；高低真空掃描電鏡，JMS-6360LV型，日本電子株式會社；X射線衍射儀，D-8型，德國Bruker公司；FTIR紅外光譜儀，Nicolet 5-DX型，美國賽默飛世爾科技公司.

Ce(NO3)3·6H2O，國藥集團化學試劑有限公司；辣根過氧化物酶，HRP，Aladdin公司，RZ>2.5；尿素，沈陽市新化試劑廠；過氧化氫，體積分數30 %；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為二次蒸餾水.實驗采用傳統的高錳酸鉀滴定法測定H2O2的準確濃度.

1.2 g-C3N4-CeO2材料的制備

1.2.1 g-C3N4的制備

稱取10.0 g尿素于研缽中[26]，研磨后倒入坩堝中，將坩堝放于烘箱中在80 ℃的溫度下干燥24 h，之后放于馬弗爐中在550 ℃條件下加熱4 h后可得到黃色粉末.用硝酸和水清洗后在80 ℃的溫度下過夜干燥即得g-C3N4.

1.2.2 g-C3N4-CeO2的制備

參照文獻[22]的合成方法,稱取0.1 g g-C3N4和0.012 6 g Ce(NO3)3·6H2O溶于19 mL水中，在室溫條件下攪拌30 min后再超聲30 min.然后在攪拌的條件下加入0.5 mL NH3·H2O，之后將混合液放在25 mL聚四氟乙烯的反應釜中在160 ℃的條件下加熱12 h,產物用水和乙醇各洗滌離心3次，最后在60 ℃的條件下過夜干燥即得到g-C3N4-CeO2材料.

1.3 g-C3N4-CeO2材料修飾電極的制備

1.3.1 CHIT溶液的配制

準確稱取0.02 g 殼聚糖(CHIT,脫乙酰度為92 %) 于小燒杯中進行溶解,加入10 mL 0.1 mol/L的乙酸,加熱攪拌使其溶解后超聲10 min制成質量分數為0.2 %的CHIT溶液.

1.3.2 g-C3N4-CeO2-HRP修飾液的制備

準確稱取0.002 g所制備的 g-C3N4-CeO2材料于小塑料管中，加入300 μL質量分數為0.2 %的CHIT溶液，超聲50 min使其混合均勻，之后加入2 mg 的HRP超聲3 min，即制得 g-C3N4-CeO2-HRP修飾液.

1.3.3 修飾電極的制備

首先將玻碳電極用0.05 μm的α-Al2O3拋光粉在拋光布上拋光至鏡面，然后依次在體積比1∶1硝酸溶液、丙酮和水中各超聲3 min 后用氮氣吹干備用.

取6 μL g-C3N4-CeO2-HRP修飾液滴涂在玻碳電極表面，晾干后把修飾電極放到已配制好的10 mmol/L氯金酸的0.5 mol/L硫酸溶液中，采用計時電流法(恒電位-0.5 V，時間分別是2、4、6、8、10、12 min)進行掃描，得到Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE修飾電極.電極在4 ℃冰箱中保存.

2 結果與討論

2.1 材料的表征及分析

2.1.1 SEM表征

圖1為g-C3N4和 g-C3N4-CeO2材料的掃描電鏡圖.從圖1(a)中可以看到g-C3N4的微觀形貌呈顆粒狀，導致這種現象的原因是合成的g-C3N4材料團聚現象嚴重.從圖1(b)中可以看出CeO2的引入改變了g-C3N4的表面形貌，與g-C3N4相比，g-C3N4-CeO2材料呈現層狀，在其表面有粉末狀顆粒附著，說明CeO2已成功的摻雜于g-C3N4中.

圖1 g-C3N4 和g-C3N4-CeO2 材料的掃描電鏡照片Fig.1 SEM images of g-C3N4 and g-C3N4-CeO2

2.1.2 XRD表征

圖2是g-C3N4和g-C3N4-CeO2的XRD圖，在圖2中a的13.2°和27.8°處出現了兩個g-C3N4的特征峰，對應的晶面分別是(100)和(002)，13.2°處的峰與g-C3N4三均三嗪環的平面堆垛結構相對應，27.8°處的峰與芳環片段的層間堆棧有關[27].圖2中b在2θ=32.5°、47.9°、56° 處出現了3個衍射峰，分別對應CeO2的(200)、(220)、(311)晶面，但是CeO2的(111)晶面卻未被觀察到，這可能是因為CeO2在復合材料中的量少，也可能是被g-C3N4在(002)處的強峰給覆蓋了[22].

圖2 g-C3N4和g-C3N4-CeO2 的X-射線衍射曲線Fig.2 XRD patterns of g-C3N4 and g-C3N4-CeO2

2.1.3 FTIR表征

圖3為g-C3N4和g-C3N4-CeO2的紅外光譜圖.圖3中a在3 000～3 500 cm-1處出現的峰為N—H的伸縮振動，1 254、1 325、1 420 cm-1是碳氮雜環的C—N伸縮振動.1 571、1 637 cm-1是C==N的伸縮振動，809 cm-1是三嗪結構的吸收峰[28].圖3中b曲線g-C3N4的所有特征吸收峰都可在g-C3N4-CeO2中找到，說明通過水熱合成后g-C3N4仍能保持其原有的結構.在1 087 cm-1處出現了一個弱的吸收峰，這可能是 Ce—O—N的伸縮振動[29]，進一步證明了CeO2較好地摻雜到g-C3N4中.

a g-C3N4 b g-C3N4-CeO2圖3 g-C3N4和g-C3N4-CeO2的紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of g-C3N4 and g-C3N4-CeO2

2.2 Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE的電化學行為

圖4為不同修飾電極在0.1 mol/L的PBS(pH=7.0，v=100 mV/s)溶液中的循環伏安圖.

a GCE b g-C3N4-CeO2/GCE c g-C3N4-HRP/GCEd g-C3N4-CeO2-HRP/GCE e Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE圖4 不同修飾電極在PBS(0.1 mol/L,pH=7.0) 溶液中的循環伏安曲線Fig.4 CVs of different modified electrods in PBS(0.1 mmol/L,pH=7.0) solution

圖4中，a為未修飾玻碳電極的循環伏安曲線，b為只修飾g-C3N4-CeO2的玻碳電極的循環伏安曲線,可以看出a、b曲線無明顯的氧化還原峰，說明g-C3N4-CeO2在電極表面不發生電子轉移.c、d分別為g-C3N4,g-C3N4-CeO2與HRP共同修飾玻碳電極的循環伏安曲線，可以看出CeO2的加入有利于電子的傳遞，d曲線在-0.4 V附近出現了HRP的還原峰，表明HRP在電極表面發生了電子轉移，但可逆性較差.e為電聚合金后修飾電極的循環伏安曲線，相比于a、b、c、d 曲線，e曲線的響應電流增大較多，且還原峰電位正移至-0.3 V，電化學反應的可逆性有所提高，說明納米金的引入加快了電子的轉移，有利于HRP的直接電子轉移.

2.3 掃速的影響

圖5為不同掃速(20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220 mV/s)下Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE在pH=7.0的PBS緩沖溶液中的循環伏安圖.由圖5可以看出：隨著掃速的增加,電流強度也隨之增大,但是氧化峰和還原峰的峰電位幾乎不變,由此可見修飾電極具有較好的電化學可逆性.還原峰電流(Ipc，μA) 和氧化峰電流(Ipa,μA) 均與掃描速度(v,mV/s)的一次方呈線性關系(圖5插圖),線性回歸方程分別為Ipc=0.908+0.107v,相關系數r=0.997 1;Ipa=-1.125-0.097v,相關系數r=-0.999 5,表明該電極反應受表面吸附過程控制[30].

1 v=20 mV/s 2 v=40 mV/s 3 v=60 mV/s 4 v=80 mV/s 5 v=100 mV/s 6 v=120 mV/s 7 v=140 mV/s 8 v=160 mV/s 9 v=180 mV/s 10 v=200 mV/s 11 v=220 mV/s圖5 不同掃速下g-C3N4-CeO2-HRP/GCE/Au的 循環伏安曲線Fig.5 CVs of g-C3N4-CeO2-HRP/GCE/Au with different scan rates

2.4 阻抗的測定

電化學阻抗(EIS)是一種表征電化學界面導電性的表征手段,用該方法可以表征電極表面的化學反應過程.如圖6中的a曲線所示，當電極沒有被修飾時圖上出現一個半圓形曲線，表明電子的傳遞受到阻礙；當電極表面被g-C3N4-CeO2-HRP修飾后,EIS曲線上的半圓弧半徑明顯增大(曲線b),說明g-C3N4-CeO2-HRP成功修飾于電極表面并影響了電子表面的傳遞；當在g-C3N4-CeO2-HRP表面再修飾納米Au后(曲線c)，導電性明顯增加，表明修飾納米金后電極具有較好的導電性，促進了溶液與電極之間的電子傳遞.

a GCE b g-C3N4-CeO2-HRP/GCE c Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE圖6 不同修飾電極的阻抗譜圖Fig.6 EIS curves of different modified electrods

2.5 實驗條件的優化

2.5.1 電化學聚合氯金酸時間對修飾電極響應電流的影響

電化學聚合氯金酸的時間長短會影響修飾電極響應電流的大小，實驗以2、4、6、8、10、12 min作為備選條件.實驗結果表明：在6 min時電極產生的響應電流最大，反應最靈敏，因此選用6 min作為實驗的最佳電聚合時間.

2.5.2 工作電位對修飾電極響應電流的影響

在-0.25～-0.45 V范圍內對響應電流值進行測定，考察工作電位對修飾電極響應電流的影響.結果表明：電位在-0.25～-0.35 V時響應電流隨著電位的減小逐漸增大，電位為-0.35 V時，產生的響應電流最大，反應最靈敏，電位低于-0.35 V時，響應電流逐漸減小.因此實驗選用-0.35 V為該傳感器的最佳工作電位.

2.5.3 pH對修飾電極響應電流的影響

pH對電極表面酶的催化活性有很大的影響.在pH為5.0～9.0范圍內考察修飾電極在0.1 mol/L PBS緩沖溶液中的響應電流的變化.實驗結果表明:在-0.35 V工作電位下，pH在5.0～7.0范圍內，修飾電極的響應電流隨著pH的增大而增大；至pH=7.0時，響應電流最大，靈敏度最高，當pH超過7.0時，響應電流呈下降趨勢.因此實驗選擇pH=7.0的PBS溶液做為測試底液.

2.6 Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE對H2O2的催化活性研究

圖7為v=100 mV/s時Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE修飾電極對H2O2的電催化響應循環伏安曲線.由圖7可以看出：在沒加入H2O2的空白PBS(0.1 mol/L,pH=7.0)溶液中，電極在0.5～-0.5 V范圍內產生了一對準可逆的氧化還原峰；當加入0.1 mmol/L的H2O2后還原峰電流顯著增大，表明Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE修飾電極對H2O2的還原具有明顯的催化作用.

圖7 加入0.1 mmol/L H2O2前后Au/g-C3N4-CeO2- HRP/GCE的循環伏安曲線Fig.7 CVs response of Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE before and after the absence of 0.1 mmol/L H2O2

2.7 Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE對H2O2的檢測范圍及檢出限

在最佳實驗條件c(PBS)=0.1 mol/L,pH=7.0,U=-0.35 V下，Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE對H2O2響應的計時電流曲線如圖8所示.由圖8可以看出：隨著溶液中H2O2濃度的增加，響應電流逐漸增大，且電催化響應很快，表明此傳感器對H2O2具有很好的催化效果.結果表明：Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE對H2O2的還原峰電流(I，μA)與其濃度(c,mmol/L)在1.0×10-5～4.6×10-3mol/L范圍內呈線性關系，線性方程為I=4.254+10.164c，相關系數為r=0.998 8，檢出限為2.6 μmol/L(S/N=3).

1 c(H2O2)=0.01 mmol/L 2 c(H2O2)=0.1 mmol/L 3 c(H2O2)=1 mmol/L圖8 Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE對不同 濃度H2O2響應的計時電流曲線Fig.8 The chronoamperometric curves of Au/g- C3N4-CeO2-HRP/GCE response to different concentrations

2.8 Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE的穩定性、重現性和干擾實驗

為考察修飾電極的穩定性，將一支Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE置于pH=7.0 的PBS緩沖溶液中，在100 mV/s的掃速下，連續進行40圈循環伏安掃描.結果表明：循環掃描40圈后，其電流響應信號仍能保持初始信號的82.1 %，說明電極具有較好的穩定性.在相同條件下，用一根Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE對1 mmol/L的H2O2重復測定5次，測定結果的相對標準偏差(RSD)為6.1 %，說明該電極具有較好的重現性.

利用計時電流法對有可能的干擾物進行測定.在優化實驗條件下，與1 mmol/L H2O2同濃度的谷氨酸，組氨酸，抗壞血酸以及10倍濃度的葡萄糖，檸檬酸，甘氨酸，乳酸，酪氨酸對H2O2的測定均不產生干擾，說明該電極具有較好的選擇性.

2.9 實際樣品測定

為驗證Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE傳感器在實際樣品中測定的可行性，用上述傳感器對自來水樣品進行加標回收實驗.取5.0 mL自來水樣品，用5.0 mL PBS(0.1 mol/L,pH=7.0)稀釋后，加入H2O2(忽略體積影響)的濃度分別為0.25,0.5和1 mol/L.分別測定樣品溶液的H2O2濃度，每個濃度樣品測定3次，結果如表1所示.由表1結果可知：Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE測定自來水樣品的加標回收率可達98.4 %～101.2 %，因此，該傳感器可以用于實際水樣的檢測.

表1 實際水樣中H2O2的測定Table 1 The determination of H2O2 in real water samples

3 結 論

采用高溫煅燒法合成g-C3N4材料，以此為基底材料摻雜CeO2制備出g-C3N4-CeO2復合材料，用殼聚糖將g-C3N4-CeO2復合材料和HRP修飾到玻碳電極表面，進一步電化學聚合納米金構建新型的Au/g-C3N4-CeO2-HRP/GCE酶傳感器.該傳感器界面具有良好的生物相容性、導電性和催化活性.該傳感器還具有較好的重現性和穩定性，對H2O2具有較好的還原效果.該研究對構建新型的電化學酶傳感器在的檢測H2O2方面有潛在的應用前景.