QuEChERS-液質聯用法快速測定涼茶中非法添加的10種止咳平喘類化學藥物

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(廣西食品藥品檢驗所,廣西南寧 530021)

涼茶是我國南方流行的一類飲料,是嶺南人民根據本地的氣候和水土特性,在長期預防疾病與保健過程中以中醫養生理論為指導,以多種藥食同源的中草藥為基礎,研制總結而來[1-3]。近年來,不法分子受利益驅使,向涼茶中非法添加化學藥物,以提高其功效。由于化學藥物有一定的副作用,大量或不正確的使用有可能導致嚴重后果,因此有必要加強對涼茶中非法添加化學藥物的分析檢測。國家對自制出售的涼茶尚未出臺強制性標準,衛生及食藥監管部門對涼茶監管尚屬空白,建立簡便、靈敏、快捷的方法來檢查產品中是否非法添加化學藥物具有重要的現實意義。

目前,涼茶中非法添加化學藥物的檢測已有報道,主要檢測對象為解熱鎮痛類及抗菌藥類化學藥物[4-6]。本實驗采用改進的QuEChERS方法[7-13]提取、凈化樣品,結合超高效液相色譜-串聯質譜儀檢測,建立宣稱止咳平喘功效的涼茶中非法添加的10種化學藥物的快速檢測方法,以期為涼茶中非法添加藥物的檢測方法作出補充,為相關監管部門日常監督提供科學、客觀的技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent 6460型串聯三重四極桿質譜,配Agilent1290型液相色譜儀 美國Agilent公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司;Agilent SB-C18柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm) 美國安捷倫公司。

8批實驗樣品 購于南寧,均宣稱有止咳、化痰、平喘功效;醋酸潑尼松(Prednisone acetate)(純度99.7%)、氫化可的松(Hydrocortisone)(純度100.0%)、地塞米松(dexamethasone)(純度99.8%)、枸櫞酸噴托維林(pentoxyverine citrate)(純度98.7%)、磷酸苯丙哌林(Benproperine Phosphate)(純度99.8%)、鹽酸溴己新(Bromhexine Hydrochloride)(純度99.9%)、鹽酸氨溴索(Ambmxol Hydochloride)(純度99.9%);醋酸可的松(cortisone acetate)(純度99.1%)、倍他米松(betamethasone)(純度99.3%);布地奈德(budesonide)(純度99.4%) 以上對照品均購自中國生物制品檢定研究院;甲醇、乙腈、甲酸 均為色譜純,美國Fisher公司;乙酸銨、氯化鈉、無水硫酸鎂 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;水 超純水,實驗室自制;C18吸附劑、乙二胺基-N-丙基吸附劑(PSA)、石墨化碳黑(GCB)吸附劑、氨丙基(NH2)吸附劑 上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 精密稱取各標準品10.0 mg,分別置于25 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配成濃度為400 mg/L的標準儲備液,在-18 ℃儲存。使用時根據需要吸取適量的各標準儲備液混合,用甲醇稀釋成質量濃度為1.0 mg/L的混合標準工作液,于-18 ℃下儲存。

1.2.2 樣品處理 準確移取樣品5.00 mL(精確至0.01 mL)于15 mL聚丙烯塑料離心管中,加入5.00 mL乙腈,渦旋1 min后加入0.5 g無水MgSO4和2.0 g NaCl,渦旋混勻,5000 r/min離心5 min,收集上清液于另一15 mL離心管中(已加入100 mg C18),渦旋2 min,5000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm有機濾膜,濾液供LC-MS/MS測定。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:Agilent SB-C18 Column(100 mm×4.6 mm,2.7 μm);流動相:A為乙腈,B為10 mmol/L醋酸銨溶液(含0.1%甲酸),梯度洗脫程序:0～5 min,30% A;5～19 min,30% A→60% A;19～20 min,60% A→30% A;20～25 min,30% A。流速:0.5 mL/min;進樣量:5 μL;柱溫:35 ℃。

1.2.4 質譜條件 電噴霧離子源(ESI);正離子掃描;多反應監測(MRM);毛細管電壓:3500 V;干燥氣溫度(TEM):350 ℃;干燥氣流速:5 L/min;鞘流氣溫度:350 ℃;鞘流氣流速:10 L/min;霧化氣壓力:40 psi;質譜采集參數見表1。

表1 10種化學藥物質譜參數Table 1 Parameter of mass spectra of 10 chemical drugs

1.3 數據處理

采用MassHunter數據處理系統(美國Agilent公司)采集數據、命名及積分,Microsoft Excel 2010(美國微軟公司)進行統計處理。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的確定

液相色譜儀接兩通,色譜條件為50%甲醇溶液作為流動相,流速為0.3 mL/min,進樣量為1 μL,采用各組分的儲備溶液以單針進樣的方式,分別在正、負離子模式下,對各待測化合物進行全掃描,以選擇合適的電離方式和準分子離子。各待測化合物在正電離模式下得到各自的準分子離子[M+H]+,再對各準分子離子產生的子離子及子離子的碎裂電壓和碰撞能量進行優化選擇,以兩個相對豐度最高的特征離子作為定性離子,并以其中相對豐度較高的子離子作為定量離子,最終確定的質譜參數見表1。

2.2 色譜條件的優化

試驗中考察了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.01 mol/L乙酸銨溶液-乙腈、0.1%甲酸溶液-甲醇和0.01 mol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)-乙腈等流動相體系對10種化學藥物的色譜峰形、分離度以及信號強度的影響。通過比較發現,水-乙腈、0.01 mol/L乙酸銨溶液-乙腈系統中,大部分化合物峰形拖尾,且信號強度低;含有甲醇體系的流動相會促使大部分化合物色譜峰拖尾、峰形鈍化;0.1%甲酸水溶液-乙腈系統中鹽酸溴己新、枸櫞酸噴托維林、磷酸苯丙哌林的峰形分叉。選擇0.01 mol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)-乙腈作為流動相,10種化學藥物的分離效果更好、信號強度相對更高,因此選擇該系統作為流動相。

梯度洗脫條件的優化:經過反復試驗,改變不同時間段流動相中有機相和水相的比例,最終確定了最佳梯度洗脫程序:0～5 min,30%乙腈;5～19 min,30%乙腈→60% 乙腈;18～19 min,60% 乙腈→30% 乙腈;0～5 min,30%乙腈。10種化學藥物的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 10種化學藥物混合標準溶液(0.05 mg/L)的LC-MS/MS色譜圖Fig.1 LC-MS/MS chromatograms of a mixed standard solution of the 10 chemical drugs(0.05 mg/L)注:1:氨溴索;2:氫化可的松;3:地塞米松;4:倍他米松; 5:鹽酸溴己新;6:枸櫞酸噴托維林;7:醋酸潑尼松; 8:醋酸可的松;9:磷酸苯丙哌林;10:布地奈德。

2.3 提取溶劑的選擇

涼茶一般為中草藥的水溶液提取物,含有大量親水性的成分,如無機鹽、糖類、鞣質、氨基酸、生物堿鹽及苷類等,基質復雜,因此需要采用適當的提取和凈化方式對樣品進行處理,以便盡可能的減少干擾,提高分析靈敏度。本實驗比較了乙腈、丙酮、乙酸乙酯等常用提取溶劑的提取效果,經過觀察發現,乙腈提取液中色素較少,故選用乙腈作為提取溶劑。

2.4 吸附劑種類和用量的選擇

QuEChERS方法中,PSA、C18、NH2和GCB是常見的吸附劑。本實驗考察了十八烷基硅烷鍵合硅膠吸附劑(C18)、乙二胺基-N-丙基吸附劑(PSA)、石墨化碳黑(GCB)吸附劑、氨丙基(NH2)吸附劑(加入量均為100 mg)的提取效果,隨著GCB的加入,大部分化合物均無信號。PSA與NH2作為吸附劑時氨溴索、地塞米松與倍他米松的回收率均低于80%,采用C18時,10種化學藥物的回收率均能達到80%以上(圖2),因此選擇C18作為吸附劑。

圖2 吸附劑對10 種化學藥物回收率的影響Fig.2 Effect of adsorbent on the recoveries of the 10 chemical drugs spiked herbal teas

2.5 除水劑用量的選擇

實驗中加入過飽和的無水MgSO4和NaCl可促使有機相與水相分層,減少共提物,提高目標物的提取效率。同時,本實驗還對兩者的用量進行了優化。在固定無水MgSO4的加入量為0.5 g時,考察了NaCl在1.0～2.5 g的使用范圍內的提取效果,結果當NaCl用量在2.0 g時,各化合物的回收率均達到最大(圖3);確定NaCl用量后,考察了無水MgSO4在0.5～2.0 g的使用范圍內的提取效果,結果無水MgSO4使用量對回收率影響不大(圖4)。因此,本實驗無水MgSO4和NaCl的最佳加入量分別為0.5、2.0 g。

圖3 氯化鈉用量對10 種化學藥物回收率的影響Fig.3 Effect of dosage of NaCl on the recoveries of the 10 chemical drugs spiked herbal teas

圖4 無水硫酸鎂用量對10 種化學藥物回收率的影響Fig.4 Effect of dosage of MgSO4 on the recoveries of the 10 chemical drugs spiked herbal teas

2.6 方法的線性關系、檢出限、回收率和精密度

取混合標準工作液用甲醇配制成系列標準溶液,分別進樣進行測定,以各組分的質量濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,線性范圍、線性方程和相關系數見表2。結果10種化學藥物在各自的質量濃度范圍內,峰面積與質量濃度呈良好的線性關系,相關系數為0.9984～0.9999。

表2 10種化學藥物的線性范圍、線性方程、相關系數(r)和檢出限Table 2 Linear range,linear equation,correlation and LOD of the 10 chemical drugs

在陰性涼茶樣品中添加不同濃度的待測物,按本研究建立的方法進行檢測,以信噪比S/N=3計算方法的檢出限,10種化學藥物的檢出限在0.1～3.0 μg/L之間。

取陰性涼茶樣品,分別添加3個濃度水平的10種待測化合物,每個水平測定3份平行樣品,考察方法的回收率和精密度。結果見表3。從中可以看出,各化合物在3個加標水平的平均回收率為67.1%～108.5%,相對標準偏差(RSD)為0.2%～6.9%。

表3 陰性涼茶樣品中10種化學藥物的加標回收率與相對標準偏差(n=3)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of the 10 chemical drugs in a blank sample(n=3)

2.7 實際樣品的測定

從南寧市場購買的8份涼茶樣品,采用本研究建立的多組分檢測方法進行測定。結果均未檢出上述化學藥物。

3 結論

將QuEChERS前處理方法應用于涼茶中非法添加化學藥物的檢測,通過對QuEChERS前處理方法及儀器色譜條件的優化,建立了定性、定量測定涼茶中氨溴索、氫化可的松、地塞米松、倍他米松、鹽酸溴己新、枸櫞酸噴托維林、醋酸潑尼松、醋酸可的松、磷酸苯丙哌林、布地奈德等10種非法添加的止咳平喘類化學藥物的檢測方法。該方法操作簡便、靈敏度高,10種待測物在各自的濃度范圍內,線性關系良好,相關系數均不小于0.9984,檢出限為0.1～3.0 μg/L,在三個不同添加水平下的平均回收率為67.1%～108.5%,相對標準偏差(RSD)為0.2%～6.9%。該方法操作簡單,凈化效果好，靈敏度高,對涼茶基質凈化效果好,可用于涼茶中10種非法添加的止咳平喘類化學藥物的快速篩查和測定。