GT和GATA轉錄因子對甘藍型油菜BnA5.FAD2和BnC5.FAD2啟動子功能的調控

劉芳，肖鋼，官春云

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GT和GATA轉錄因子對甘藍型油菜和啟動子功能的調控

劉芳1，肖鋼2，官春云1

（1湖南農業大學農學院/國家油料改良中心湖南分中心，長沙 410128；2湖南省水稻油菜抗病育種重點實驗室，長沙 410128）

【目的】脂肪酸去飽和酶2基因（）是控制油菜中油酸含量的重要基因，通過研究GATA和GT轉錄因子與和啟動子的互作關系及其轉錄調控機制，為高油酸油菜育種提供分子理論基礎。【方法】通過缺失啟動子片段及生物信息學分析，預測和啟動子區潛在順式作用元件；從PlantTFDB轉錄因子數據庫中篩選候選轉錄因子，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測轉錄因子的表達規律，并與和表達規律對比，進一步篩選候選轉錄因子；利用酵母單雜交驗證轉錄因子與啟動子序列的互作情況；將轉錄因子與和啟動子序列共轉入擬南芥，通過Western blot檢測報告基因GFP的蛋白表達情況，分析轉錄因子對于啟動子功能的影響。【結果】單獨敲除和啟動子中的GT或GATA順式作用元件后，GFP蛋白豐度均下降，表明GT和GATA順式作用元件在調節基因轉錄中起重要作用。酵母單雜交結果顯示，GATA家族轉錄因子（、和）和GT家族轉錄因子（和）可以與和啟動子相互作用。Western blot結果顯示，當GATA家族轉錄因子與含有GATA元件的啟動子片段共轉化擬南芥時，GFP蛋白含量明顯高于無轉錄因子時，當敲除GATA元件時，GFP蛋白含量無明顯變化；當GT家族轉錄因子與含有GT元件的啟動子片段共轉化擬南芥時，GFP蛋白含量有明顯變化，當敲除GT元件時，GFP蛋白含量無明顯變化。【結論】GATA家族的轉錄因子Bna010243-1、Bna026124-1和Bna026124-2可以與和啟動子中GATA元件相互作用，增強基因的表達水平。GT家族的轉錄因子Bna010915可以與和啟動子中的GT元件發生互作，正向調節基因表達；Bna013749通過與和啟動子中的GT元件發生互作，負向調節基因表達。

甘藍型油菜；GATA轉錄因子；GT轉錄因子；啟動子；啟動子

0 引言

【研究意義】油酸是多種脂肪酸的前體，通常存在于內質網中，以油酸-CoA、油酸-PLA、油酸-DAG、油酸-PC和油酸-TAG等形式參與油酸代謝。脂肪酸去飽和酶基因（）是負責將油酸轉化成亞油酸的關鍵基因，甘藍型油菜中位于A5和C5染色體上的對于油菜種子中油酸含量具有重要影響[1]。目前，高油酸育種及其形成機理已然成為各類油料作物的研究熱點[2]。通過研究其轉錄調控機制，為高油酸油菜育種提供分子理論基礎。【前人研究進展】目前，植物脂肪酸去飽和酶主要在轉錄水平被調控[3]，而且的轉錄水平受外界刺激影響。例如，在低溫誘導下，棉花轉錄物水平增加[4]；釀酒酵母中油酸調控基因的轉錄水平會被外源性不飽和脂肪酸抑制，但在缺氧條件下轉錄水平會增加[5]。真核生物的轉錄過程十分復雜，需要多種轉錄因子參與，轉錄因子多與啟動子上的特異序列結合，起始轉錄或調節轉錄水平。GATA家族轉錄因子通過識別并結合GATA元件調節基因的轉錄水平。GATA家族轉錄因子廣泛存在于動、植物和真菌中，對（T/A）GATA（A/G）序列具有很高的親和力。1991年首次發現GATA-1，與GATA-2、GATA-3、GATA-4、GATA-5、GATA-6組成GATA家族[6]。GATA元件通常位于啟動子、轉錄起始位點的上游和增強子中[7]。在植物中，發現含有GATA序列的I-box元件存在于rbcs、cab和nia啟動子的上游，對光和晝夜節律有響應[8]。GT轉錄因子通常與GT元件結合，調節基因表達以響應內、外部刺激。目前，僅在植物中發現GT轉錄因子[9]，與之結合的GT元件通常是富含T和A的核心序列[10]。GT轉錄因子最初在豌豆核中被發現，與GT-1元件結合[11]。研究表明GT元件可以參與光調節[12-13]，參與野生大麥水分脅迫的調節[14]。GT元件的拷貝數以及拷貝之間的間隔對啟動子的轉錄功能都有影響[15]。不同的GT轉錄因子與GT元件結合后，會發揮不同的調節功能[16]。Le Gourrierec等[17]發現GT-1轉錄因子可以結合并穩定酵母細胞中的TF IIA-TBP-TATA復合物以調節基因表達，認為GT-1轉錄因子可以與轉錄起始復合物結合直接參與轉錄調節。【本研究切入點】目前，高油酸育種已成為研究熱點，對于的研究也較普遍，但對于轉錄水平調控的研究鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】本研究通過敲除部分啟動子片段來研究2個啟動子和的同源區域，并找到控制基因表達的關鍵啟動子區域。通過PlantCARE網站分析，獲得潛在的調控元件，借助PlantTFDB網站篩選可能與之結合的轉錄因子，繼而分別在酵母和擬南芥中驗證啟動子序列和轉錄因子的互作關系，為高油酸油菜育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜湘油15種在湖南農業大學耘園基地大田，于2017年3月至5月取不同生長時期的種子。擬南芥（，Col-0）由湖南農業大學油料作物研究所提供，種在培養箱內，24℃/16 h光照，22℃/8 h黑暗培養。pEASY-T1載體、大腸桿菌T1感受態購于北京全式金公司。酵母菌種Y187（-Trp/-Leu/-His）由山東農業大學作物生物學國家重點實驗室饋贈，酵母單雜交報告載體pHIS2、pGADT7載體、PRI101載體為湖南農業大學油料研究所保存。本研究中所用引物均由南京金斯瑞公司合成。

1.2 BnA5.FAD2和BnC5.FAD2啟動子同源區的分析

啟動子區分為4個不同的區域，分別命名為A（-1—-213 bp）、B（-214—-225 bp）、C（-226—-314 bp）和D（-315—-685 bp），分別構建載體HM-DCBA：GUS/GFP（-685—-1 bp+內含子）、HM-CBA：GUS/GFP（-314—-1 bp+內含子）、HM-BA：GUS/GFP（-225—-1 bp+內含子）和HM-A（-213—-1 bp +內含子）（圖1-a）。啟動子區分為4個不同的區域，分別命名為A′（-1—-215 bp）、B′（-216—-227 bp）、C′（-228—-312 bp）和D′（-313—-671 bp），分別構建載體HM-D′C′B′A′：GUS/GFP（-671—-1 bp+內含子）、HM-C′B′A′：GUS/GFP（-312—-1 bp+內含子）、HM-B′A′：GUS/GFP（-227—-1 bp+內含子）和HM-A′（-215—-1 bp+內含子）（圖1-b）。分別敲除C、C′區域，構建植物表達載體（圖1-c和圖1-d）。分別敲除GT元件和GATA元件核心序列，構建植物表達載體（圖2-a和圖2-b）。載體構建中所用引物見電子附表1。所有構建的載體通過凍融法[18]轉入農桿菌菌株GV3101中。然后通過花序浸染法轉化野生擬南芥[19]。在含有50 mg·L-1潮霉素B的MS平板上篩選轉基因植株，然后移植到土壤中培養。從T2代轉基因擬南芥種子中提取總蛋白質，通過Western blot檢測GFP蛋白含量，具體操作參考劉睿洋等[20]方法。

1.3 GATA家族和GT家族基因的篩選及克隆

利用PlantTFDB網站分析，從甘藍型油菜中獲得31個GATA轉錄因子基因，其中19個完整序列，與油菜數據庫（http://brassicadb.org/brad/）保持高度同源性的序列共16個。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析表達模式，以cDNA為模板，選擇作為內參基因，每個模板3個重復，進行qRT-PCR檢測。PCR反應體系為SYBR Premix Ex Taq 9 μl、引物各0.5 μl、模板1 μl，ddH2O補齊20 μl。PCR反應程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環。以甘藍型油菜基因組為模板，克隆GATA家族的轉錄因子基因（、、和）和GT家族轉錄因子（和）。

1.4 酵母單雜交鑒定啟動子與轉錄因子的互作

根據Infusion試劑盒（TaRaKa，Japan）說明書，將和啟動子克隆到pHIS2.0載體中的GAL4-DNA結合結構域中，將GATA家族和GT家族轉錄因子編碼區序列與pGADT7載體中的GAL4激活結構域融合。

將pHIS2-A5-promoter和pHIS2-C5-promoter載體分別轉化到營養缺陷型酵母菌株Y187，篩選出陽性菌株后將其涂布到SD-Trp固體平板和含不同濃度3-AT（0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 mmol·L-1）的固體SD-Trp-His培養基上，30℃培養3—5 d，觀察其生長情況，篩選最適3-氨基-1,2,4-唑（3-AT）生長濃度。按照電子附表2的組合進行酵母轉化，驗證GATA和GT家族基因的功能。將含有轉化子的酵母菌涂在營養缺陷培養基上（SD-Trp、SD-Trp-Leu-His+適當濃度的3-AT），30℃培養3—5 d。觀察酵母生長情況。

1.5 在擬南芥中的分析轉錄因子與啟動子的互作情況

為了鑒定轉錄因子基因、、、和的功能，將其分別克隆并與pRI101載體連接，篩選標記為卡那霉素，構建載體時將血細胞凝集素（HA）標簽與轉錄因子基因融合，同時轉入載體pRI101，便于進一步檢測是否轉化成功。構建載體命名為pRI101-Bna010243-1∷HA、pRI101-Bna026124-1∷HA、pRI101-Bna026124- 2∷HA、pRI101-Bna010915∷HA和pRI101-Bna013749∷HA。將以上載體分別轉化已含有和啟動子片段的擬南芥。經50 mg·L-1潮霉素B+70mg·L-1卡那霉素的MS平板篩選轉基因擬南芥，然后移植到土壤中繼續培養。從T2代轉基因擬南芥種子中提取總蛋白質通過Western blot檢測HA蛋白含量，用于判斷轉錄因子是否成功轉化擬南芥，通過Western blot檢測GFP蛋白含量用于判斷轉錄因子對于啟動子功能的影響，從而判斷轉錄因子是否與啟動子序列互作，具體操作同1.2。

2 結果

2.1 GT和GATA順式作用元件在調節BnA5.FAD2和BnC5.FAD2轉錄中的作用

湖南農業大學油料研究所前期克隆了和啟動子序列[21-22]，二者約680 bp序列（，686 bp；，676 bp）保持91%的同源性，這一同源區域對于基因表達量的貢獻巨大。和啟動子區分別分為4個區域A（A′）、B（B′）、C（C′）和D（D′），構建植物表達載體，轉化擬南芥，采用Western blot技術檢測報告基因GFP的蛋白豐度。結果顯示，當區域D和D′缺失時，GFP蛋白的豐度增加，表明該區域可能存在一些負向調控元件，抑制基因表達。隨著區域C和C′的進一步缺失，GFP蛋白豐度下降，預示該區域中存在一些用于控制基因表達的正調控元件；進一步敲除區域B和B′后，HM-A（A′）的GFP蛋白豐度一定程度的高于HM-BA（B′A′），即GFP蛋白豐度呈現增加的現象，說明B（B′）區存在一些負調控元件調節基因表達（圖1-e和圖1-f）。可見，啟動子C（-226—-314 bp）區域和啟動子C′（-228—-312 bp）區域是保持基因高度表達的關鍵區域。

a：BnA5.FAD2啟動子不同長度同源區的載體構建模式圖；b：BnC5.FAD2啟動子不同長度同源區的載體構建模式圖；c：敲除BnA5.FAD2啟動子的C區域后構建載體模式圖；d：敲除BnC5.FAD2啟動子C′區域后構建載體模式圖；e：含有不同長度BnA5.FAD2啟動子片段的轉基因擬南芥種子中GFP蛋白豐度檢測；f：含有不同長度 BnC5.FAD2啟動子片段的轉基因擬南芥種子中GFP蛋白豐度檢測；g：含有敲除C區域的BnA5.FAD2啟動子片段的轉基因擬南芥種子中GFP蛋白豐度檢測；h：含有敲除C′區域的BnA5.FAD2啟動子片段的轉基因擬南芥種子中GFP蛋白豐度檢測

為了進一步驗證C（-226—-314 bp）區域和C′（-228—-312 bp）的功能，分別敲除這兩個區域并構建載體-C和-C′（圖1-c和圖1-d）。結果發現，區域C和C′缺失時，GFP蛋白質豐度均降低（圖1-g和圖1-h）。表明啟動子的-226—-314 bp和啟動子的-228—-312 bp是控制甘藍型油菜種子中和表達的關鍵區域。

啟動子的-226—-314 bp和啟動子的-228—-312 bp僅存在一個堿基差異，經PlantCARE軟件預測發現這兩個區域均存在GT和GATA順式作用元件，分別為GT家族和GATA家族轉錄因子的結合位點。分別敲除2個元件并構建載體-GT和-GATA與-GT′和GATA′（圖2-a和圖2-b），轉化擬南芥進行功能分析。結果顯示，分別單獨敲除BnC5.FAD2啟動子的GT和GATA順式作用元件后，均會造成GFP蛋白豐度顯著下降（圖2-d），表明啟動子的GT和GATA順式作用元件在調節基因轉錄中起重要作用。分別單獨敲除2啟動子的GT和GATA順式作用元件后，GFP蛋白豐度顯著下降（圖2-c），表明啟動子中GT和GATA順式作用元件在調節基因轉錄中起重要作用。

a：敲除BnA5.FAD2啟動子GT、GATA元件后構建載體模式圖；b：敲除BnC5.FAD2啟動子GT、GATA元件后構建載體模式圖；c：敲除BnA5.FAD2啟動子的GT、GATA元件后轉基因擬南芥種子中GFP蛋白豐度檢測；d：敲除BnC5.FAD2啟動子的GT、GATA元件后轉基因擬南芥種子中GFP蛋白豐度檢測

2.2 GATA家族和GT家族基因的表達分析和蛋白序列分析

通過qRT-PCR分析轉錄因子表達規律（圖3），發現GATA轉錄因子家族中的表達規律與一致，而、和的表達規律與一致；GT轉錄因子家族中的表達規律與一致，的表達規律與一致。

a：油菜種子不同發育時期GATA家族基因表達分析；b：油菜種子不同發育時期GT家族基因表達分析；c：油菜種子不同發育時期BnA5.FAD2表達分析；d：油菜種子不同發育時期BnC5.FAD2表達分析

以甘藍型油菜湘油15基因組和cDNA基因組序列為模板，克隆GATA家族和GT家族基因，分別為（903 bp，301）、（594 bp，198）、（567 bp，189）、（963 bp，321）、（546 bp，182）、（582 bp，194）、（681 bp，227）和（1 239 bp，413）。GATA家族蛋白均具有保守的單個18個殘基的鋅指結構（CX2CX18CX2C），與其他作物中GATA蛋白結構相同（圖4-a），GT家族中Bna013749蛋白和Bna010915蛋白的3個α-螺旋構成Trihelix結構，而且每個串聯重復區具有1個色氨酸殘基，符合W-Xn-W-Xn-W的結構特點，Bna010915蛋白第3個α-螺旋中的保守W被F替代（圖4-b），與GT-2家族的結構特點相同[23]，可能屬于GT-2亞家族成員。

a：GATA家族蛋白序列分析；b：GT家族蛋白序列分析

2.3 GATA和GT家族在酵母中的功能分析

為了排除報告基因基底水平表達的影響，需確定適當濃度的3-AT，排除干擾。結果表明，pHIS2-A5- promoter的最佳濃度為50 mmol·L-1，pHIS2-C5-promoter動子的最佳濃度為35 mmol·L-1（圖5-a）。將共轉化的酵母菌液涂布在SD-Trp-Leu（SD-TL）和SD-Trp- Leu-His（SD-TLH）+3-AT（35 mmol·L-1/50 mmol·L-1）的固體培養基上，并在30℃條件下孵育。觀察生長情況3—5 d（圖5-b），所有共轉化的酵母組合物可以在SD-T-L固體培養基平板上正常生長。在SD-TL-H+ 50 mmol·L-13-AT三缺板上，與pHIS2-A5-promoter共轉化酵母的Bna010243-1、Bna026124-1、Bna026124-2、Bna010915、Bna013749可以生長，即表明Bna010243-1、Bna026124-1、Bna026124-2、Bna010915和Bna013749可以與啟動子相互作用。在SD-T-L-H+35 mmol·L-13-AT三缺板上，與pHIS2-C5-promoter共轉化酵母的Bna010243-1、Bna026124-1、Bna026124-2、Bna010915和Bna013749可以生長，即表明啟動子也可與Bna010243-1、Bna026124-1、Bna026124-2、Bna010915和Bna013749相互作用。

a：選擇合適的3-AT濃度；b：轉錄因子和啟動子的互作分析

2.4 GATA和GT家族在擬南芥中與BnA5.FAD和BnC5. FAD2啟動子互作分析

將GATA轉錄因子家族的、和分別構建到pRI101載體中，然后分別轉化具有HM-CBA、HM-C′B′A′、-GATA或-GATA′的轉基因擬南芥，（圖6-i和圖6-j）；將GT轉錄因子家族的和分別構建到pRI101載體中，轉化具有HM-CBA、HM-C′B′A′、-GT和-GT′的轉基因擬南芥（圖6-k和圖6-l）。經western blot檢測證明轉錄因子均轉染擬南芥，并且可以正常表達（圖6-m）。檢測報告基因GFP蛋白豐度的變化，鑒定轉錄因子與或啟動子互作與否（圖6），當擬南芥含有GATA家族轉錄因子基因之一和HM-CBA或HM-C′B′A′時，GFP蛋白質豐度有不同程度的增加（圖6-a和圖6-e）。但當GATA順式作用元件被敲除時，GFP蛋白豐度沒有顯著變化（圖6-b和圖6-f）。說明轉錄因子基因、和可以與或啟動子發生相互作用，而且作用位點在GATA元件這一位置，而且互作的結果均是提高基因表達量。當和HM-CBA或HM-C′B′A′共轉化擬南芥時，相對于僅含有HM-CBA或HM-C′B′A′的擬南芥，GFP蛋白豐度略有增加（圖6-c和圖6-g）；當基因和HM-CBA或HM-C′B′A′共轉化到擬南芥中時，GFP蛋白豐度降低（圖6-c和圖6-g）；當GT順式元件被敲除時，共轉化之后的擬南芥GFP蛋白豐度沒有顯著變化（圖6-d和圖6-h）。推測Bna010915可能作為一個正調控因子，Bna013749作為一個負調控因子，二者均可與或啟動子區的GT元件相互作用，調節基因的表達水平。

a：啟動子BnA5.FAD2與GATA家族轉錄因子在擬南芥中的互作分析；b：敲除GATA元件后的啟動子BnA5.FAD2與GATA家族轉錄因子在擬南芥中的互作分析；c：啟動子BnA5.FAD2與GT家族轉錄因子在擬南芥中的互作分析；d：敲除GT元件后的啟動子BnA5.FAD2與GT家族轉錄因子在擬南芥中的互作分析；e：啟動子BnC5.FAD2與GATA家族轉錄因子在擬南芥中的互作分析；f：敲除GATA元件后的啟動子BnC5.FAD2與GATA家族轉錄因子在擬南芥中的互作分析；g：啟動子BnC5.FAD2與GT家族轉錄因子在擬南芥中的互作分析；h：敲除GT元件后的啟動子BnC5.FAD2與GT家族轉錄因子在擬南芥中的互作分析；i—l：啟動子和轉錄因子共轉化擬南芥的模式圖；m：轉錄因子在擬南芥中表達檢測圖

a: interaction analysis between promoterand GATA family transcription factors in; b: interaction analysis between promoterlacking GATA cis-element and GATA family transcription factors in; c: interaction analysis between promoterand GT family transcription factors in; d: interaction analysis between promoterlacking GT cis-element and GATA family transcription factors in; e: interaction analysis between promoterand GATA family transcription factors in; f: interaction analysis between promoterlacking GATA cis-element and GATA family transcription factors in; g: interaction analysis between promoterand GT family transcription factors in; h: interaction analysis between promoterlacking GT cis-element and GATA family transcription factors in; i-l: model diagram of co-transformation promoters and transcription factors into; m: Expression detection of transcription factors in

圖6 轉錄因子和啟動子在擬南芥中的互作分析

Fig. 6 The interaction analysis of transcription factor and promoters in

3 討論

3.1 GT轉錄因子與啟動子互作功能分析

轉錄水平的調控在植物基因調控中起重要作用，這一過程涉及多種順式作用元件和反式作用因子。啟動子上的順式作用元件與特定的轉錄因子結合能夠調節基因轉錄的起始，轉錄效率以及時空特異性[24]。本研究預測到2個潛在順式元件GATA和GT，與之結合的轉錄因子為GATA家族和GT家族轉錄因子。

GT元件首先在豌豆葉中的rbcS-3A啟動子中被鑒定為光反應元件[11]，但在多數啟動子中功能不明確。本研究發現當GT元件或GATA元件分別被單獨敲除時，報告基因GFP的表達量出現不同程度的降低，初步說明GT和GATA可能與其相應的轉錄調控因子結合后調控基因的表達上調。在水稻低表達的成熟組織中，屬于GT家族的OsGT-2轉錄因子可以上調的表達量，將水稻啟動子轉入煙草原生質體中分析，發現也是表現為上調因子的功能[25]。GT元件結合GT轉錄因子可以調節基因轉錄水平以抵抗不利環境[26]。GT家族基因屬于Trihelix家族，Trihelix家族是植物所特有的[27]，而且trihelix結構域具有高度保守性[28]。本研究發現，GT家族基因和均具有trihelix結構，且符合W-Xn-W-Xn-W結構特點，其中Bna010915蛋白第3個α-螺旋中的保守W被F替代，與GT-2家族的結構特點相同，可能屬于GT-2亞家族成員。研究發現ASIL1屬于trihelix家族的新的亞科，作為擬南芥種子基因中的負調節因子[29]。本研究發現，對于和啟動子也起到負調控的作用，與ASIL1功能相似，推測其可能與ALIL1屬于同一亞科。

3.2 GATA轉錄因子與啟動子的互作功能分析

GATA家族轉錄因子識別GATA元件并與WGATAR（W是T或A；R是G或A）序列結合[30]。該家族的DNA結合結構域通常具有廣泛存在于真核生物中的Ⅳ鋅指（CX2CX17-20CX2C）的結構[31]。本文中克隆的GATA轉錄因子基因都具有Ⅳ鋅指（CX2CX18CX2C）（圖4），和啟動子上含有WGATAR序列，推測本研究中克隆的GATA轉錄因子可能與和啟動子上的GATA序列相互作用，參與基因表達的調控，但需要進一步的試驗驗證。酵母單雜交試驗以及轉錄因子Bna010243-1、Bna026124-1、Bna026124-2與部分啟動子序列（HM-CBA或HM-C′B′A′）共轉染擬南芥的試驗結果表明，、、可以與和啟動子中GATA元件相互作用（圖6），而且3個轉錄因子均表現為正向調控的功能。

4 結論

GATA家族的轉錄因子Bna010243-1、Bna026124- 1、Bna026124-2可以與和啟動子中GATA元件相互作用，增強基因的表達水平。GT家族的轉錄因子Bna010915可以與和基動子中的GT元件發生互作，正向調節基因表達；Bna013749通過與啟動子和啟動子的GT元件發生互作，負向調節基因表達。

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Regulation of GT and GATA Transcription Factors on Promoter Function ofandGenes in

Liu Fang1, Xiao Gang2, Guan Chunyun1

(1College of Agriculture, Hunan Agricultural University/National oilseed crops improvement center in Hunan, Changsha 410128;2Hunan Provincial Key Laboratory of Rice and Rapeseed Breeding for Disease Resistance, Changsha 410128)

【Objective】 Fatty acid desaturase 2 gene () is an important gene for controlling oleic acid content in rapeseed. And in this paper, the interaction between GATA family andandgene promoters or GT family transcription factors andandgene promoters was studied to make sure the transcription regulation mechanism to provide the theoretical basis for high oleic acid breeding. 【Method】 The potential cis-elements were predicted by deletion of promoter fragments and bioinformatics analysis, and candidate transcription factors were screened from PlantTFDB transcription factor database. Real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression pattern of transcription factors to further screen candidate transcription factors by comparison withandgene expression patterns. Transcription factors were co-transformed withandgenepromoters into yeast and verified interaction relationship between promoter and transcription factors by yeast one-hybrid. The transcription factors were transformed intowithandgenepromoter sequence, and the reporter gene GFP was detected by western blot to analyze the effects of transcription factors on promoters. 【Result】 After knocking out the GT or GATA cis-elements fromandgene promoters respectively, the GFP protein abundance decreased, which indicate that GT and GATA cis-elements play important roles in regulating gene transcription. Yeast one-hybrid results showed that the GATA family transcription factors (Bna010243-1, Bna026124-1, Bna026124-2) and the GT family transcription factors (Bna010915 and Bna013749) can interact withandgene promoters. Western blot analysis showed that when the GATA family transcription factor and the promoter fragment containing GATA elements were co-transformed into, the GFP protein content was significantly higher than that of no transcription factor. When the GATA element was knocked out, the GFP protein content did not change significantly. When the GT family transcription factor and the promoter fragment containing the GT element were co-transformed into, the GFP protein content changed significantly. When the GT element was knocked out, the GFP protein content did not change significantly.【Conclusion】 The GATA family transcription factors Bna010243-1, Bna026124-1, Bna026124-2 can interact with the GATA elements in theandgene promoters to enhance gene expression levels. The GT family transcription factor Bna010915 interacts with the GT elements in theandgene promoters to positively regulate gene expression; Bna013749 interacts with the GT elements in theandgene promoters to negatively regulate gene expression.

; GATA transcription factor; GT transcription factor;promoter;promoter

2018-07-13；

2018-09-25

國家重點基礎研究發展計劃“973”計劃（2015CB150200）

劉芳，E-mail：g5n2a5f@163.com。

官春云，E-mail：guancy2011@aliyun.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.24.002

（責任編輯 李莉）