去甲斑蝥素抑制黑色素瘤M14細胞增殖和誘導細胞凋亡的研究

高楊，程毅，任明媛，岳育楊

黑色素瘤（黑素瘤）是一種好發于皮膚的高度惡性腫瘤，易轉移、死亡率高、預后差，缺乏有效的治療藥物［1-2］。近年來腫瘤的免疫治療研究進展較快，美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）陸續批準了抗細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）單克隆抗體ipilimumab、抗程序性死亡受體1蛋白（programmed cell death protein 1，PD-1）單克隆抗體nivolumab和pembrolizumab用于黑素瘤的治療［3］，但這些藥物可能導致自身免疫性疾病和胃腸毒性而使部分患者終止治療，因此繼續尋找有效的治療藥物仍是臨床急需解決的問題。斑蝥素是從斑蝥的干燥蟲體中提取的一種抗腫瘤活性成分，具有抗腫瘤、升白細胞、增強免疫、抗病毒、抑菌及抗氧化等作用［4］，去甲斑蝥素（noncantharidin，NCTD）是斑蝥素的衍生物，由人工合成，其毒副作用比斑蝥素低，具有獨特的升白細胞及較強的抗癌作用［5］。本研究通過NCTD作用于人黑色素瘤M14細胞，觀察NCTD對M14細胞增殖、凋亡及凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的影響，并探討其可能的抗黑素瘤作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人M14黑素瘤細胞株購于中國科學院上海細胞研究所；NCTD購于美國Sigma公司，DMEM培養基購于美國Gibco公司，CCK-8試劑購于日本同仁化學研究所，兔抗人β-actin一抗、兔抗人Bax一抗、兔抗人Bcl-2一抗及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購于武漢ABclonal公司。倒置顯微鏡購于德國Leica公司，CO2培養箱購于美國Thermo公司。

1.2 方法 M14細胞培養于含10%胎牛血清的1640培養基，于37℃，5%CO2的恒溫培養箱中常規培養。倒置顯微鏡下觀察細胞形態和生長狀態，待細胞融合達到90%以上時，按1∶2或1∶3的比例進行傳代。

1.3 藥物處理 NCTD溶于DMSO中，配成100 g/L儲存液凍存于-20℃冰箱中備用，臨用時用細胞培養液配制成工作濃度。

1.4 CCK-8法檢測細胞活性 將對數生長期的M14細胞接種于96孔板中，每孔5×103個細胞，每組設5個平行孔，待細胞貼壁后，棄去原培養液，實驗組每孔加入100 μL的NCTD，濃度分別為50、100及500 μg/L，陰性對照組加入不含藥物的培養基，空白對照組只加培養基（無細胞）。分別作用24 h、48 h后，每孔加10 μL CCK-8試劑作用2 h，用酶標儀測定每孔450 nm波長的吸光度（A）值并計算生長抑制率。生長抑制率=［（Ac-As）/（Ac-Ab）］×100%。（Ac：陰性對照孔；As：實驗孔；Ab：空白對照孔）

1.5 倒置顯微鏡觀察細胞形態及DAPI核染色 將M14細胞常規培養于6孔板中，待細胞貼壁后，分別加入以不同濃度的NCTD作用24 h后，4%多聚甲醛固定15 min，用PBS室溫清洗3遍，每次10 min，0.1%triton-X 100處理5 min，PBS室溫清洗3遍，每孔加入濃度為1 mg/L的DAPI染液，常溫避光孵育10 min，后用PBS清洗3遍后，于倒置顯微鏡觀察細胞形態變化，熒光顯微鏡觀察細胞核的變化。

1.6 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達 藥物持續干預細胞24 h后，收集并裂解細胞，BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白量。樣本經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（100 V恒壓）分離，以凝膠面積0.65 mA/cm2恒流電轉移45 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入1∶1 000的兔抗人Bax一抗、兔抗人Bcl-2一抗，4℃孵育過夜，漂洗后加入1∶3 000的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37℃避光孵育1 h，TBST洗滌，ECL化學發光顯色試劑盒曝光顯影。利用Image J圖像分析系統對條帶進行分析和測量灰度值，以β-actin蛋白作為內參。

1.7 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示。多樣本比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NCTD抑制M14細胞增殖 CCK-8結果顯示，NCTD可抑制黑素瘤M14細胞的增殖，藥物作用24 h及48 h后各組的細胞生長抑制率差異有統計學意義（F分別為135.76、96.12，P＜0.05），經兩兩比較，各時點時50 μg/L與陰性對照（0 μg/L）組的抑制率差異無統計學意義，其余組間差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Effects of different concentrations of norcantharidin on the proliferation of melanoma M14 cells圖1 不同濃度NCTD對黑素瘤M14細胞增殖的影響

2.2 NCTD誘導M14細胞凋亡情況 經NCTD處理過的細胞形態發生變化，輪廓不規整，胞核皺縮，體積變小，細胞黏附性差，漂浮細胞增多，見圖2。DAPI染核后通過熒光顯微鏡觀察，未經藥物處理的細胞核形態正常，經藥物處理過的細胞出現核固縮、核邊集及凋亡小體，見圖3。

Fig.2 The effect of different concentrations of norcantharidin on the morphology of melanoma M14 cells（×200）圖2 倒置顯微鏡下觀察不同濃度NCTD對黑素瘤M14細胞形態的影響（×200）

2.3 NCTD影響凋亡相關蛋白的表達 0、50、100及500 μg/L組凋亡抑制蛋白Bcl-2相對表達量依次為0.84±0.09、0.81±0.07、0.61±0.11、0.44±0.07，呈逐漸降低趨勢（F=16.059，P＜0.05）。凋亡相關蛋白Bax相對表達量依次為0.04±0.01、0.52±0.05、0.71±0.06、0.82±0.09，呈逐漸升高趨勢（F=139.822，P＜0.05），見圖4。

Fig.3 Effect of different concentrations of norcantharidin on melanoma M14 cell nuclei under fluorescence microscope（DAPI，×AP0）圖3 熒光顯微鏡下觀察不同濃度NCTD對黑素瘤M14細胞核的影響（DAPI，×AP0）

3 討論

惡性黑素瘤起源于神經外胚葉，近年來其發病率呈大幅度持續上升趨勢，在女性中的增長速度僅次于肺癌，在男性則是腫瘤中增長速度最快的一型［6］。惡性黑素瘤大多數由黑痣惡變而來，原發病變90%在皮膚，多發生于頭皮、頸部、手掌、小腿、足底、指（趾）等，也可發生在軀干皮膚，少數發生于皮膚以外的部位，如眼內、食管、直腸和肛門、陰道等。晚期黑素瘤對放療和化療不敏感，預后差，因此尋找治療黑素瘤的有效藥物是臨床上亟待解決的問題，近年來美國FDA已陸續批準了干擾素［7］和免疫檢查點抑制劑［3］等藥物用于晚期黑素瘤的治療，但遠期療效還有待于進一步觀察。

斑蝥是我國的傳統中藥，斑蝥素是一種倍半萜類衍生物，是斑蝥抗癌的有效成分，然而斑蝥素可引起強烈的消化道反應，損傷腎功能。NCTD為斑蝥素的衍生物，是人工合成的一種新型抗癌藥物，化學結構與斑蝥素相似［5］，目前已有研究表明，NCTD能顯著抑制人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞的增殖、侵襲、黏附、遷移能力，其機制可能與下調血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）、MMP-9蛋白表達有關［8］；NCTD還能夠抑制骨髓瘤U266細胞增殖，誘導細胞凋亡，認為可能與調控Notch信號通路有關［9］；此外，NCTD可通過阻滯細胞周期誘導肺腺癌A549［10］和胃癌SGC-7901細胞［11］凋亡；并通過抑制乳腺癌MCF-7細胞［12］血管生成能力而發揮抗腫瘤作用。然而其在黑素瘤中的作用尚鮮見報道。

Fig.4 The protein expressions of Bax and Bcl-2 in different groups of melanoma M14 cells圖4 不同濃度NCTD對黑素瘤M14細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

本實驗通過NCTD體外作用于人黑色素瘤M14細胞，應用CCK-8法證實了NCTD對黑素瘤細胞具有明顯的生長抑制作用，并呈劑量依賴性。熒光顯微鏡下可見細胞核固縮、核邊集及凋亡小體等細胞凋亡形態學改變，證實NCTD對人黑色素瘤M14細胞有抑制增殖作用，這與已發現的NCTD對骨髓瘤U266細胞、人肺腺癌A549細胞等的作用相同，說明NCTD確有抑制細胞增殖功能，但處理24、48 h時50 μg/L組與陰性對照組的抑制率差異無統計學意義，提示藥物需達到較高濃度才能起效，其作用機制可能與促進細胞凋亡有關。Bcl-2和Bax是調控細胞凋亡的重要分子［13］。因此，結合上述研究，筆者認為NCTD可促進黑素瘤M14細胞中促凋亡分子Bax的表達，抑制抗凋亡分子Bcl-2的表達，由此可進一步誘導黑素瘤M14細胞的凋亡，推測NCTD誘導黑素瘤M14細胞凋亡的機制與促進Bax和抑制Bcl-2的表達有關。

綜上所述，NCTD可有效抑制黑素瘤M14細胞增殖，其作用機制可能與促進細胞凋亡有關，NCTD有望成為輔助治療惡性黑素瘤的藥物之一。