乙肝病毒X結(jié)合蛋白在肝細(xì)胞癌中表達(dá)及臨床意義

司 超 劉 俊 李霞斌 姚輝華

(西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000)

肝細(xì)胞癌(以下簡稱肝癌)是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第二位。肝癌具有起病隱匿、進(jìn)展迅速、惡性程度高和術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，因此肝癌患者的病死率也是居高不下，占癌癥相關(guān)死因的第三位〔1〕。早期診斷和治療能夠明顯提高肝癌患者的臨床治愈率、降低術(shù)后復(fù)發(fā)率和延長生存時間。研究表明很多分子標(biāo)志物在腫瘤的早期診斷及預(yù)后評估中具有重要的價值。乙肝病毒X結(jié)合蛋白(HBXIP)是一種多功能的細(xì)胞組成型蛋白，能夠與乙肝病毒DNA編碼的X蛋白(HBX)的羧基末端結(jié)合，改變乙肝病毒的復(fù)制周期〔2〕。研究表明，HBXIP的表達(dá)在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和胃癌等多種惡性腫瘤中顯著升高，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)〔3，4〕。目前關(guān)于HBXIP與肝癌之間相關(guān)性的研究尚少見報道，本研究旨在探討HBXIP蛋白在肝癌中表達(dá)及其與腫瘤臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 2014年12月至2017年4月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的肝癌存檔石蠟標(biāo)本54例，另選取手術(shù)切緣無腫瘤細(xì)胞浸入的肝組織標(biāo)本29例作為癌旁對照與正常肝組織15例(肝囊腫14例、肝血管瘤1例)。肝癌患者年齡36～73歲，平均(48.6±9.32)歲。肝癌患者術(shù)前均未行放化療等輔助治療，術(shù)后病理證實為肝細(xì)胞癌。

1.2試劑和方法 HBXIP兔抗人單克隆抗體購自美國CST公司，乙二胺四乙酸(EDTA)修復(fù)液、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)公司。采用免疫組化EnVision法檢測HBXIP的表達(dá)，具體操作主要參照試劑盒說明書進(jìn)行：對包埋石蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，脫蠟水化，3%雙氧水消除過氧化物酶活性，EDTA修復(fù)液高溫高壓修復(fù)抗原，滴加一抗后27℃孵育60 min，滴加二抗后27℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用預(yù)實驗中陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn) 以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒判定為HBXIP表達(dá)陽性。由兩位病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片，每張切片高倍視野(×400倍)下隨機(jī)選取5個視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)的比例進(jìn)行綜合評估。染色強(qiáng)度：細(xì)胞無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞數(shù)：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。然后將染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)的評分相加，總的評分<2分為陰性，≥2分為陽性。

1.4統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HBXIP在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá) HBXIP的陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈彌漫性棕黃色顆粒；HBXIP在肝癌組織中的陽性表達(dá)率〔73.6%(39/54)〕明顯高于癌旁組織〔48.3%(14/29)〕和正常肝組織〔33.3%(5/15)〕(P<0.05)；而在癌旁組織與正常肝組織中表達(dá)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2HBXIP表達(dá)與肝癌臨床病例特征的關(guān)系 肝癌組織中HBXIP表達(dá)與組織分化、癌栓形成、TNM分期相關(guān)(P<0.05)，而與肝癌患者的性別、年齡、腫瘤數(shù)目、腫瘤直徑、乙肝表面抗原(HBsAg)、血清甲胎蛋白(AFP)水平、肝硬化、腫瘤轉(zhuǎn)移、肝功能分級、包膜是否完整等無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 HBXIP陽性表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

肝癌的形成是一個多因素、多基因共同參與的生物學(xué)過程，而癌基因激活和抑癌基因缺失在這個過程中發(fā)揮重要的作用。HBXIP最早是由Melegari等〔2〕從肝癌HepG2細(xì)胞中篩選得到的細(xì)胞組成型蛋白，全長由173個氨基酸組成，分子量為18 kD，其編碼基因位于人染色體1號染色體短臂(1p13.2)上。HBXIP是一種多功能的調(diào)節(jié)蛋白，能夠與HBX蛋白和survivin蛋白相結(jié)合形成復(fù)合物，抑制caspase9的激活，從而抑制線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑〔5〕。HBXIP可以通過激活PI3/蛋白激酶B(Akt)信號通路〔6〕，調(diào)控小鼠雙微體基因(MDM)2/p53負(fù)反饋環(huán)〔7〕，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的糖代謝〔8〕和脂代謝〔9〕等途徑來促進(jìn)細(xì)胞增殖。HBXIP可以激活A(yù)kt/內(nèi)皮型一氧化氮合酶信號通路或上調(diào)成纖維生長因子(FGF)8、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管形成〔10，11〕。HBXIP還能通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MEKK)2/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2/鈣蛋白酶小亞基(Capn)4信號通路和調(diào)節(jié)組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(GCN)5介導(dǎo)的α-微管蛋白乙酰化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移〔12，13〕。HBXIP在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等，并與腫瘤的生長、浸潤轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。馮姝婷等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)HBXIP在肝癌BEL7402、7721、HepG2、HepG3細(xì)胞中的表達(dá)較高。

本研究結(jié)果與樸俊杰等〔3〕關(guān)于HBXIP在胃癌中的研究基本一致，但李曉剛等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)HBXIP在膀胱癌的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，這種表達(dá)差異可能是HBXIP在不同腫瘤中的致癌機(jī)制存在差異或HBXIP抗體的生產(chǎn)廠家不同引起的。本文結(jié)果與李巍巍等〔15〕對HBXIP在子宮內(nèi)膜癌中的研究相似，表明HBXIP在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程起重要的作用。本研究提示HBXIP的高表達(dá)可能促進(jìn)了肝癌的惡性分化、浸潤轉(zhuǎn)移和臨床進(jìn)展。已有研究顯示，肝癌的組織分化和癌栓形成是影響腫瘤預(yù)后的重要因素〔16〕，因此，推測HBXIP可能在肝癌的預(yù)后評估中有一定的參考價值，但是關(guān)于HBXIP在肝癌發(fā)生和發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制仍不清楚，有待今后在分子水平上的深入研究。

綜上，HBXIP在肝癌中表達(dá)上調(diào)，是肝癌發(fā)生發(fā)展過程中重要的調(diào)節(jié)因子。HBXIP表達(dá)與肝癌的浸潤轉(zhuǎn)移、惡性分化和臨床進(jìn)展相關(guān)，可能成為肝癌診斷和預(yù)后評估的分子標(biāo)志物。