衰老對大鼠結腸干細胞增殖分化功能及微環境的影響

程志豪 頓耀艷 劉 潔 李玉婷 郭煜暉 何毓敏 袁 丁 張長城

(三峽大學醫學院，湖北 宜昌 443002)

Effectsofagingoncolonstemcellsandmicroenvironmentinrat

CHENGZhi-Hao,DUNYao-Yan,LIUJie,etal.

MedicalCollegeofThreeGorgesUniversity,Yichang443002,Hubei,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes of rat colon stem cells and their microenvironment of Wnt/β-catenin signaling pathway during the aging process.MethodsMale SD rats at different developmental stages were divided into adult group(6 months)and aging group(24 months), 10 rats in each group.Routine periodate and Schiff reagent (PAS) staining, alcianblue staining, immunohistochemistry and RT-PCR were used to detect changes in adult group and aging group colon stem cell proliferation and differentiation and Wnt/β-catenin signaling pathway.ResultsCompared with those of adult group, the number of goblet cells in aging group were decreased(P<0.01), mRNA expressions of stem cell markers Lgr5, Bmi-1, MUC1,MUC2 were reduced(P<0.01), the expression of PCNA was increased(P<0.01), the microenvironment Wnt/β-catenin signaling pathway related proteinβ-catenin expression was increased(P<0.05), the expression of GSK-3β was decreased(P<0.01).ConclusionsDuring the rat aging process, the number of colon stem cells and the globet cell differentiation of intestinal stem cells are reduced, the proliferation of colon stem cells are increased , Wnt/β-catenin signal pathway is up-regulated.

【Keywords】 Aging; Colon stem cells; Wnt/β-catenin signal pathway

研究顯示，機體的衰老始于腸道衰老〔1〕。腸道主要功能是吸收營養物質及作為一個屏障阻擋細菌、病毒等有害物質進入機體。衰老過程中，腸道免疫系統受到損害、炎癥反應也增加，老年人經常出現慢性便秘、排便障礙和尿失禁等癥狀及對腸道感染的易感性增加〔2〕。腸黏膜在機體中更新頻率最高，而腸黏膜不斷更新依賴于腸道干細胞的增殖、分化。結腸上皮的單層柱狀上皮內陷并被固有層包圍形成隱窩，每個隱窩由其中的腸干細胞維持〔3〕。結腸組織中存在多種類型的干細胞，在維持結腸正常生理功能和促進黏膜炎癥傷口愈合中有重要作用〔4〕。

腸道干細胞主要分為兩種：Lgr5(G-protein-coupled receptor-5)標記的窩基底柱狀細胞(CBC)為活化的干細胞；而另一種Bmi-1(Bmilpolycombringfinger oncogene 1)特異性標記的DNA 標記滯留細胞(LRC)處于靜止狀態〔5，6〕。大量研究表明，腸道干細胞受其所處的微環境中Wnt/β-catenin通路調控〔7〕。有研究表明，衰老伴隨干細胞增殖分化功能的改變及干細胞的衰退〔8〕。本課題組前期研究顯示，衰老大鼠小腸干細胞數量減少，干細胞微環境Wnt/β-catenin信號下調〔9〕。但衰老過程中大鼠結腸干細胞的增殖分化功能及其微環境是否發生變化尚不明確。本研究旨在探討衰老過程中大鼠結腸干細胞增殖分化功能及其微環境中Wnt/β-catenin信號通路的變化。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級6月齡、24月齡雄性SD大鼠各10只，購自三峽大學醫學院實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(鄂) 2011-0061。

1.2主要試劑 RNA逆轉錄試劑盒，日本TaKaRa公司；Lgr5、Bmi-1、MUC1、MUC2、β-actin 引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列：Lgr5上游(5′→3′)CCTGGGAAAGCAAACCCG，下游(5′→3′)CGGAATCGGAAGGCAAGTC；Bmi-1上游(5′→3′)ACTCTGGGAGCGACAAGGC，下游(5′→3′)GATGATTTCCGAGGTCTACTGGC；MUC1上游(5′→3′)CACTCACGGACGCTATGTGC，下游(5′→3′)GGTTGGTGTAAGAGAGACCGCTAC；MUC2上游(5′→3′)CACGACACCAGGACCTTTCC，下游(5′→3′)TGCTTGGGAGGCACGAAG；β-actin上游(5′→3′)TGACCGAGCGTGGCTACAG，下游(5′→3′)CAGGGAGGAAGAGGATGCG。一抗β-catenin、GSK-3β，美國 Santa Cruz公司。

1.3主要儀器 攤片烤片機(CS-V1)，宏業醫用(湖北孝感)儀器有限公司；超薄切片機(ULTR ACUTR)，Leica 公司(德國)；光學倒置顯微鏡(CX41)，日本Olympus公司；1-15K離心機，德國 Sigma公司；JB-3恒溫磁力攪拌器，常州澳華司樂儀器(AHYQ)有限公司。

1.4方法

1.4.1動物分組及樣品處理 大鼠分為成年組(6月齡大鼠)、老年組(24月齡大鼠)各10只。自由飲水，禁食24 h。麻醉后取血打開腹腔，取近端結腸段1～2 cm，放入包埋盒并立即投入4%多聚甲醛中，4℃固定24 h后更換75%酒精，常規脫水，石蠟包埋。

1.4.2HE染色、高碘酸-雪夫試劑(PAS)染色和阿利新藍染色 石蠟連續切片，每張厚4 μm，每隔5張取1張，依次在冷水、熱水中攤開后黏附于載玻片上，60℃烤4 h。切片機連續切片(4 μm)，經過冷水、45℃熱水攤片后黏附于載玻片上，60℃烤4 h。阿利新藍染色：常規脫蠟后，先蒸餾水沖洗，然后甩干液體立即滴加阿利新藍染液，孵育5 min，蒸餾水沖洗干凈，甩干后每個組織上滴加一滴核固紅染液室溫孵育2 min，流水沖洗后吹干封片。PAS染色：常規脫蠟后，用蒸餾水沖洗，甩干每張玻片上的蒸餾水，滴加高碘酸染液孵育10 min，流水沖洗后，甩干組織上的水分，滴加一滴雪夫試劑避光孵育10 min，流水沖洗，滴加蘇木素染液1 min，流水沖洗，吹干封片。顯微鏡取圖，每組隨機取5只大鼠，每只大鼠結腸各取3張不連續切片。阿利新藍、PAS染色計數不同組別每只大鼠10個隱窩杯狀細胞的數量，取平均值。

1.4.3免疫組織化學染色 結腸組織石蠟切片每張厚4 μm，黏附于防脫載玻片上，60℃烤4 h。常規脫蠟后，用蒸餾水浸泡3 min，配制檸檬酸鹽修復液高壓修復6 min，修復完后自然冷卻至室溫。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次5 min，甩干后滴加3%過氧化氫(H2O2)37℃孵育10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，甩干水分后每個組織滴加一滴5%半血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h，PBS沖洗干凈后，加一抗濕盒中4℃孵育過夜，PBS沖洗；二抗室溫孵育1 h，PBS沖洗，甩干后臨時用蒸餾水配制二氨基聯苯胺(DAB)顯色，顯色完成后流水沖洗，甩干后滴加蘇木素40 s，鹽酸酒精分化1 s，流水沖洗后脫水，風干封片。取圖后分析并計算增殖細胞核抗原(PCNA)、β-catenin、GSK-3β表達。

1.4.4RT-PCR 稱取適量新鮮結腸組織，提取組織中的總RNA，并用焦磷酸二乙酯(DEPC)水溶解，核酸測定儀測定RNA濃度，計算D(λ)260/D(λ)280比值，重復測定2次，兩次測得的結果均在1.8～2.2，且兩次測得濃度相差不得超過20 μg/ml。逆轉錄，擴增。擴增反應體系總體積為25 μl：10.5 μl DEPC水，12.5 μl PCR Master mix (2倍)，Lgr5、Bmi-1、MUC1、MUC2引物上、下游各0.5 μl，然后加入cDNA模板1 μl。β-actin作為內參。擴增條件：94℃5 min，94℃、30 s，55℃、30 s，72℃30 s，GOTO2，35個循環，72℃、5 min，4℃低溫保存。配制2%瓊脂糖凝膠，將擴增得到的產物加入到配制好的凝膠孔中進行電泳30 min，凝膠成像儀拍照保存內參和目的條帶，運用Image J軟件計算Lgr5、Bmi-1、MUC1、MUC2與β-actin光密度比值。

1.5統計學處理 采用SPSS18.0軟件行獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1衰老對大鼠結腸組織干細胞標記物Lgr5、Bmi-1 mRNA的影響 與成年組比較，老年組Lgr5、Bmi-1 mRNA表達量顯著降低(P<0.01)。見圖1，表1。

圖1 兩組結腸組織Lgr5、Bmi-1 mRNA表達比較

組別Lgr5Bmi-1MUC1MUC2成年組0.91±0.141.10±0.161.50±0.191.48±0.18老年組0.36±0.121)0.48±0.141)0.72±0.171)0.82±0.111)

與成年組比較:1)P<0.01

2.2衰老對大鼠結腸杯狀細胞數量及分泌功能的影響 杯狀細胞可以分泌被PAS染成紅色的中性黏蛋白和被阿利新藍染成藍色的酸性黏蛋白。結果如表1，圖2，表2所示，在結腸組織中與成年組比較，老年組結腸組織杯狀細胞數量及MUC1、MUC2 mRNA表達顯著降低(P<0.01)。

圖2 各組結腸組織杯狀細胞數量(×200)及MUC1、MUC2 mRNA的變化

組別阿利新藍染色PAS染色成年組21.83±2.0218.33±0.57老年組14.33±1.891)12.67±1.041)

與成年組比較：1)P<0.01

2.3衰老對大鼠結腸組織PCNA蛋白表達的影響 與成年組比較，老年組大鼠結腸隱窩PCNA蛋白表達量顯著增高(P<0.01)。見圖3，表3。

2.4衰老對大鼠結腸組織β-catenin、GSK-3β蛋白表達的影響 免疫組化染色結果如表3，圖4所示，與成年組比較，老年組大鼠結腸組織β-catenin蛋白表達增加，GSK-3β蛋白表達量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

圖3 兩組結腸組織PCNA表達(×200)

組別PCNAβ-cateninGSK-3β成年組0.09±0.010.59±0.050.76±0.05老年組0.29±0.042)0.73±0.021)0.39±0.062)

與成年組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

圖4 各組大鼠結腸組織β-catenin、GSK-3β的表達(×200)

3 討 論

腸道干細胞位于隱窩的基底部，是腸道黏膜上皮正常再生及維持腸屏障功能的重要基礎。Barker等〔10〕研究發現，在結腸隱窩底部中表達Lgr5的細胞能夠分化成為黏膜中所有細胞類型。在小腸干細胞中，Lgr5特異性標記的CBC主要用于組織更新，Bmi-1特異性標記的LRC作為儲備亞群，在組織損傷等情況下被激活。雖然有研究顯示果蠅衰老時腸道干細胞的數量增多、分化成熟的細胞數量減少〔11〕，但在衰老過程中也有許多組織出現干細胞數量減少。PCNA可以反映細胞的增殖能力。前期研究表明，自然衰老大鼠中，小腸組織中Lgr5、Bmi-1、PCNA表達隨年齡的增加有下調的趨勢〔8〕。本研究結果顯示，自然衰老過程中，大鼠結腸組織中Lgr5、Bmi-1 mRNA表達降低，而PCNA表達增高，表明衰老過程中大鼠結腸干細胞數量減少，結腸干細胞增殖能力增強。

腸道黏膜的黏液屏障功能的重要生理功能是抵御腸道細菌、病毒等有害物質，因此保持結腸黏膜完整性至關重要，而干細胞是結腸黏膜再生的基礎。位于結腸隱窩底部的多能干細胞可以分化為腸細胞、杯狀細胞和內分泌細胞這些最終分化的細胞〔4〕。腸道黏液屏障重要成分是腸道杯狀細胞分泌的黏蛋白(MUC)，其中MUC1、MUC2是杯狀細胞分泌的黏蛋白，對維持腸道穩態有重要作用。有研究表明老年小鼠腸道杯狀細胞數量減少，MUC1、MUC2表達降低〔12〕。杯狀細胞的數量及分泌功能可以反映結腸干細胞的分化功能。本研究結果顯示，衰老大鼠杯狀細胞數量明顯減少，MUC1和MUC2表達明顯降低，表明衰老過程中大鼠結腸干細胞向杯狀細胞分化能力減弱。

腸道干細胞所處的微環境對其功能有重要影響，如Wnt/β-catenin 信號通路〔13〕。Wnt信號通路主要是胞膜外的Wnt蛋白結合卷曲蛋白和低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)5/6組成受體復合物，導致β-catenin聚集，并轉位進入細胞核，導致一系列干細胞相關的基因轉錄。有研究表明，如將Wnt/β-catenin信號通路的腺瘤性結腸息肉病(APC)基因失活或β-catenin過度活化，小腸增殖將會出現失控〔14〕。本研究發現，衰老過程中，大鼠結腸組織β-catenin表達增多、GSK-3β的表達減少，表明衰老過程中大鼠結腸組織的Wnt/β-catenin 信號通路上調。

本研究顯示，衰老過程中結腸干細胞數量減少、增殖能力增強、分化能力減弱，其微環境Wnt/β-catenin信號通路活化。腸道干細胞是腸道黏膜更新和維持腸屏障功能的重要基礎，衰老過程中，大鼠結腸干細胞數量、增殖分化功能及其微環境的改變可能是衰老過程中一些腸道相關疾病發生的重要基礎，本研究對于進一步探討衰老過程中結腸干細胞衰退的機制、改善衰老相關腸道疾病提供了一種新的思路。