β-淀粉樣蛋白在老齡大鼠術后認知功能障礙中的作用及石杉堿甲的干預作用

鄧福謀 羅曉東 郎海麗 姚 鵬 方四通 陳 勇 余樹春 徐國海

(南昌大學第二附屬醫院麻醉科 江西省麻醉學重點實驗室，江西 南昌 330006)

術后認知功能障礙(POCD)是指患者在手術后出現認知功能(包括學習、記憶、情緒、情感及判斷力等)整體下降或衰退〔1,2〕，目前其發病機制尚不完全清楚，也尚未發現有效改善POCD的藥物及方法。β-淀粉樣蛋白(Aβ)是一種功能未完全明確的跨膜蛋白，已被證實與阿爾茨海默病(AD)早期老年斑形成關系密切,與神經功能損傷有密切關系，也被稱為是AD的始動因子〔3〕。石杉堿甲(HupA)是一種天然新型石松類生物堿有效單體，同時也是一種高效可逆性的膽堿酯酶抑制劑，具有改善學習及記憶功能的作用〔4,5〕，但其是否可減輕老齡大鼠術后認知功能及Aβ是否參與其減輕POCD的過程尚不清楚，本研究擬評價HupA對老齡大鼠POCD的影響及Aβ在其中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組及處理 健康老年雄性SD大鼠(南昌大學實驗動物科學部提供)72只，20～22月齡，體重550～700 g，采用隨機數字表法分為對照組(C組)、POCD組(P組)和Hup A組(H組)，每組24只。H組和C組在手術前給予Hup A(河南竹林眾生制藥公司，批號：20150101)0.15 mg·kg-1·d-1灌胃，連續3 w，P組按體重給予等容量生理鹽水；3 w后P組和H組行脾切除術，C組不行手術。

1.2模型制備 參照文獻〔6〕介紹的方法采用脾切除術建立老齡大鼠術后認知功能障礙模型。術前禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg，待麻醉成功后仰臥位固定，腹部皮膚備皮，消毒鋪巾，正中切口開腹，游離脾臟，結扎脾動靜脈，將脾臟切除后止血關腹，用無菌敷料貼覆蓋，膠布固定，待大鼠蘇醒后單獨飼養。術中嚴格無菌操作，術畢腹腔內給予5%頭孢哌酮注射液50 mg/kg預防傷口感染。

1.3大鼠認知功能的測定 采用Morris水迷宮進行測試。所有大鼠于術前5 d進行適應性學習，每天在水迷宮中自由游泳5 min以適應環境，分別于手術后第1、3天和7天(T1～T3)時進行觀察，分別從四個象限的池壁中點將大鼠面向池壁放入池中，記錄其在120 s內尋找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。術后第8天，將原平臺撤除，記錄其在120 s內穿越原先平臺所在位置的次數，即為穿越平臺次數。

1.4血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-10濃度的測定 分別于T1～T3時每組隨機取8只大鼠，采集血樣，采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)測定血清TNF-α、IL-6和IL-10濃度。實驗步驟按照試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明書操作。

1.5海馬Aβ表達的測定 分別于T1～T3時每組隨機取8只大鼠的海馬組織，勻漿，加入蛋白裂解液，提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，1∶5加入6×上樣緩沖液，100℃水浴鍋煮沸10 min，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，敷一抗4℃孵育過夜，次日TBST漂洗10 min×3次，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(稀釋度1∶5 000)室溫孵育1 h，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，采用GelPro4.5 圖像分析軟件，以光密度值與內參β-actin光密度值的比值反映目的蛋白表達水平。

1.6統計學處理 應用SPSS20.0軟件，計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1三組術后各時點逃避潛伏期和穿越平臺次數比較 與C組比較，P組T1～T3時點逃避潛伏期延長，H組T1時逃避潛伏期延長，P組和H組穿越平臺次數均減少(P<0.05)；與P組比較，H組T1～T3時點逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增加(P<0.05)，見表1。

表1 三組術后各時點逃避潛伏期和穿越平臺次數比較

與C組比較：1)P<0.05；與P組比較：2)P<0.05；下表同

2.2三組血清TNF-α、IL-6、IL-10及海馬Aβ表達比較 與C組比較，P組和H組血清TNF-α、IL-6及IL-10濃度均升高(P<0.05)；與P組比較，H組血清TNF-α及IL-6濃度降低，IL-10濃度升高(P<0.05)，見表2。與C組比較，P組和H組海馬Aβ表達上調(P<0.05)；與P組比較，H組海馬Aβ表達下調(P<0.05)，見表3、圖1。

表2 三組術后各時點血清TNF-α、IL-6及IL-10濃度比較

表3 三組術后各時點海馬Aβ表達比較

圖1 三組海馬Aβ表達比較

3 討 論

雖然POCD的發病原因尚未完全清楚，但年齡是目前唯一已確定的因素，伴隨著年齡的增加，POCD的發生率也顯著升高，尤其是年齡超過70歲的老年患者〔7〕。同樣在動物實驗中也已經證實，老齡大鼠術后空間記憶力較年輕大鼠明顯降低〔8〕。因此，本研究選取老齡大鼠作為研究對象。

Morris水迷宮實驗是評價嚙齒類動物空間學習記憶功能最經典的方法〔9〕。本研究顯示，手術操作可導致老齡大鼠術后出現認知功能障礙，表明老齡大鼠POCD模型制備成功。本研究結果顯是示術前給予HupA可減輕老齡大鼠術后認知功能障礙。

TNF-α和IL-6是機體炎性反應中重要的促炎性細胞因子，IL-10則是公認的炎癥及免疫抑制因子。本研究結果表明，手術應激可引起老齡大鼠圍術期炎性細胞因子釋放增多并誘發炎性反應，而術前給予HupA可降低圍術期炎性細胞因子的釋放，從而在一定程度上減輕炎性反應，其機制可能是HupA通過增強膽堿能抗炎通路減輕炎性反應。

Aβ是AD患者老年斑中的主要組成成分，同時也是神經損傷和炎癥反應潛在的標記物，可誘發神經遞質失調及突觸功能障礙，導致乙酰膽堿合成減少；同時也可促進炎性細胞因子表達，誘導神經元凋亡及神經膠質細胞增生，從而導致學習和記憶功能障礙〔11〕。本研究結果提示HupA可減輕老齡大鼠術后認知功能障礙，其機制可能與其下調海馬組織Aβ表達有關。HupA是一種高選擇性的可逆性膽堿酯酶抑制劑，易通過血腦屏障，發揮擬膽堿作用，抑制乙酰膽堿水解，從而增加神經突觸間隙的乙酰膽堿含量〔12〕；HupA還能減少谷氨酸誘發的神經元凋亡，保護神經元對抗Aβ產生的氧化應激反應及神經細胞凋亡作用〔13〕；還具有抑制一氧化氮(NO)的神經毒性及對記憶損害的修復作用〔4〕；此外，HupA還可對膽堿能受體發揮直接作用，刺激毒蕈堿乙酰膽堿受體，并激活蛋白激酶C(PKC)，增加α-分泌酶活性，從而減少Aβ的產生〔14〕。

綜上所述，HupA可減輕老齡大鼠術后認知功能障礙，機制可能與其降低炎性反應及下調海馬組織Aβ表達有關。