法舒地爾對肝纖維化大鼠肝臟缺血再灌注損傷的有效劑量

向 華 黃攀科 蘇 銘 楊 軍 王 謙

(遵義醫(yī)學院附屬貴航三○○醫(yī)院普通外科，貴州 貴陽 550009)

肝纖維化是病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病等進展到肝硬化的共同病理過程〔1〕。晚期肝纖維化導致的肝硬化是一種由肝纖維組織增生，細胞彌漫性變性、壞死，肝細胞結(jié)節(jié)狀再生反復交錯導致肝臟變硬、變形的慢性肝臟疾病〔2〕。肝硬化常伴隨多種并發(fā)癥，如門脈高壓和肝功能減退等。肝硬化患者常需要肝切除或肝移植手術(shù)。在肝移植或肝葉切除等過程中，肝缺血再灌注損傷(HIRI)不可避免，是影響手術(shù)效果的重要因素之一。枯否細胞活化、多種細胞因子釋放和氧化應激均與HIRI有密切關(guān)系，而這些因素可激活肝星狀細胞(HSC)，促進肝纖維化進程〔3〕。Rho及其下游的Rho激酶(ROCK)在細胞增殖、黏附和遷移等調(diào)控中發(fā)揮重要作用，RhoA/ROCK 信號轉(zhuǎn)導通路被證實在肝纖維化進程中扮演重要角色〔4〕。法舒地爾作為ROCK抑制劑，可通過抑制ROCK活性，阻斷Rho/ROCK信號通路，從而延緩肝纖維化，發(fā)揮肝臟保護作用〔5〕。本研究擬探討法舒地爾對肝纖維化大鼠HIRI的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 清潔級雄性SD大鼠90只，體重230～260 g，平均(250±15)g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。大鼠適應性飼養(yǎng)1 w。

1.2主要試劑 鹽酸法舒地爾注射液(四川升和藥業(yè)股份有限公司)；水合氯醛合劑(美國Sigma公司)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒(上海銘博生物科技有限公司)；其他試劑均為分析純國產(chǎn)試劑。

1.3主要儀器 超凈工作臺(AIRTECH，蘇州凈化設備有限公司)，紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)，iChem-530全自動生化分析儀(深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司)。

1.4肝纖維化動物模型構(gòu)建 SD大鼠90只隨機分為實驗組(n=85)和對照組(n=5)。手術(shù)前12 h禁食不禁水，麻醉(10%水合氯醛)，仰位固定于固定板上，備皮、碘胺酮消毒鋪巾，沿腹部正中線作2 cm切口，發(fā)現(xiàn)胃幽門部，于十二指腸降部腸系膜中發(fā)現(xiàn)白色有韌性的膽管，游離膽總管，采用2根5-0號縫線結(jié)扎膽總管。術(shù)后縫合皮膚，肌肉注射青霉素80萬U 2～3 d。對照組不做膽總管結(jié)扎及離斷，其余操作同實驗組。術(shù)后正常飼養(yǎng)，適當控制飲食，密切觀察大鼠生活狀態(tài)變化，于術(shù)后第7和14天分別皮下注射 50 μg VitK1，術(shù)后第18天實驗組隨機選取5只大鼠和對照組所有大鼠，處死，取肝左外葉制作石蠟切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝組織病理學形態(tài)，肝纖維化大鼠模型建立成功標準為肝組織病理切片顯示纖維化病變。

1.5干預方法 采用隨機數(shù)字表法將實驗組剩余80只大鼠分為假手術(shù)組、HIRI組、法舒地爾1組和法舒地爾2組，每組20只。開腹顯露肝蒂，假手術(shù)組和HIRI組經(jīng)腹腔注射生理鹽水5 ml/kg;法舒地爾1組和法舒地爾2組分別注射20 μg/kg和80 μg/kg法舒地爾；HIRI組、法舒地爾1組和法舒地爾2組30 min后阻斷肝門20 min，假手術(shù)組不阻斷肝門，解除阻斷并關(guān)腹，術(shù)畢4 h取各組6只大鼠血液和肝組織標本進行相關(guān)指標的檢測。

1.6AST、ALT、MDA、SOD和TNF-α檢測 采集各組大鼠眼眶血，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測TNF-α，以水溶性四唑鹽法檢測肝組織 SOD活性，以硫代巴比妥酸法檢測肝組織 MDA 水平，以ELISA法檢測血清AST、ALT水平。

1.7HE染色 取左肝外葉組織，制備組織病理切片，切片脫蠟，水洗，經(jīng)蘇木素染色5 min，水洗，70%酒精和1%鹽酸分化，返藍，水洗，伊紅染色，酒精脫水，二甲苯透明，封片后于顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.896 h死亡率 記錄各組余14只大鼠96 h生存情況，統(tǒng)計生存率。

1.9統(tǒng)計分析 采用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗，生存率分析采用Kaplan-Meier法。

2 結(jié) 果

2.14組肝功能比較 與假手術(shù)組相比，HIRI組、法舒地爾1組和法舒地爾2組血清AST和ALT水平顯著上升(P<0.05)；法舒地爾1組和法舒地爾2組血清AST和ALT水平顯著低于HIRI組(P<0.05)，且法舒地爾2組顯著低于法舒地爾1組(P<0.05)。見表1。

表1 4組血清AST、ALT水平及肝組織MDA、SOD含量比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與HIRI組比較：2)P<0.05；與法舒地爾1組比較：3)P<0.05

2.24組肝組織MDA和SOD含量比較 與假手術(shù)組相比，HIRI組、法舒地爾1組和法舒地爾2組肝組織MDA含量顯著上升，SOD含量顯著下降(P<0.05)；法舒地爾1組和法舒地爾2組肝組織MDA含量均顯著低于HIRI組(P<0.05)，SOD含量顯著高于HIRI組(P<0.05)，且法舒地爾2組和法舒地爾1組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.34組血清TNF-α水平比較 與假手術(shù)組〔(33.19±5.16)pg/ml〕相比，HIRI組、法舒地爾1組和法舒地爾2組血清TNF-α水平〔(63.22±11.75)、(51.36±12.15)、(45.38±8.52)pg/ml〕顯著上升(P<0.05)；法舒地爾1組和法舒地爾2組顯著低于HIRI組(P<0.05)，且法舒地爾2組顯著低于法舒地爾1組(P<0.05)。

2.4HE染色 假手術(shù)組肝組織切片可見纖維結(jié)締組織增生、小葉結(jié)構(gòu)紊亂，假小葉形成；HIRI組肝組織切片可見中心粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，部分出現(xiàn)肝細胞壞死；法舒地爾1組和法舒地爾2組同樣可見中心粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，但肝細胞壞死明顯減輕。見圖1。

2.5生存率 假手術(shù)組、HIRI組、法舒地爾1組和法舒地爾2組96 h生存率分別為78.57%、28.57%、50.00%和64.29%。法舒地爾1組和法舒地爾2組與HIRI組總體生存時間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 組織病理觀察(HE，×100)

圖2 各組96 h生存率比較

3 討 論

在肝部分切除手術(shù)中，為了降低手術(shù)出血量，外科醫(yī)生需要使用Pringle法阻斷第一肝門，然而由于第一肝門的阻斷基本阻斷入肝血流，可導致肝臟缺血損傷，而術(shù)后解除阻斷后即可發(fā)生HIRI。HIRI不僅可能影響肝臟正常功能的恢復，而且可導致心、肺、腎等器官受累〔6～8〕。研究表明，肝門阻斷技術(shù)雖然可顯著降低肝部分切除手術(shù)中出血量，但并不能降低患者術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率。主要是由于肝臟對HIRI高度敏感，HIRI可導致肝衰竭甚至死亡〔9〕。因此，亟需解決肝部分切除手術(shù)中Pringle法導致的HIRI對肝臟的損傷。HIRI的病理生理過程十分復雜，目前其確切機制尚不十分清楚，主要與炎癥反應、氧化應激、細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡和自噬等有關(guān)〔10，11〕。隨著研究的深入，目前臨床上對HIRI的干預方法越來越多，如缺血預處理和藥物處理等，但由于前者存在增加相應并發(fā)癥、手術(shù)時間和促進血栓形成的風險，其臨床應用受到限制，而藥物處理受到廣泛關(guān)注〔12〕。ROCK是一種研究較為清楚的重要激酶之一，其主要功能是參與細胞骨架的重構(gòu)、細胞遷移、黏附和分裂及調(diào)節(jié)中性粒細胞產(chǎn)生活性氧等，在炎癥導致的細胞組織損傷中發(fā)揮重要作用〔13〕。研究證實，RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導通路與缺血性腦血管疾病密切相關(guān)〔14〕。RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導通路可被過氧化物、過氧化低密度脂蛋白、血管內(nèi)皮生長因子等激活。

本研究結(jié)果表明，法舒地爾有助于減輕缺血再灌注引起的肝損傷，并呈劑量依賴性。SOD是機體內(nèi)清除氧自由基的主要酶類之一，HIRI可抑制其活性，從而導致大量超氧自由基積累，直接破壞肝細胞。MDA是一種不飽和脂肪酸氧化分解后的產(chǎn)物，其含量高低提示組織細胞遭受過氧化損傷程度。本研究結(jié)果證明，法舒地爾可增強抗氧化應激能力，從而減輕肝組織過氧化損傷。洪曉鵬等〔15〕報道，法舒地爾對大鼠缺血再灌注損傷肝臟具有保護作用，可能與抑制中性粒細胞浸潤和提高機體抗氧化應激能力有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。作為ROCK抑制劑，法舒地爾是一種新型異喹啉磺胺衍生物，抑制RhoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導通路介導的HSC活化，從而起到肝臟保護作用〔16〕。細胞因子是導致RhoA/ROCK激活的重要因素之一，TNF-α被證實參與了肝衰竭過程，阻斷TNF-α有助于阻斷肝臟壞死的發(fā)生〔17〕。另外，本文結(jié)果表明，法舒地爾有助于提高肝衰竭動物生存率。陳少華等〔18〕報道，法舒地爾對梗阻性黃疸大鼠肝切除后肝衰竭模型具有保護作用，提高生存率。綜上，法舒地爾對肝纖維化大鼠HIRI后肝臟具有保護作用，且呈劑量依賴性，可能通過提高機體的抗氧化能力，降低炎癥細胞因子水平和脂質(zhì)過氧化水平而發(fā)揮作用。