NOD2基因敲除對帕金森病模型中黑質細胞凋亡的影響及對多巴胺神經元的保護作用

王德佳 楊 波

(承德市中心醫院神經內科，河北 承德 067000)

帕金森病(PD)是一種常見的中老年人神經變性疾病，主要臨床表現有運動遲緩、姿勢步態障礙、靜止性震顫和肌強直等。PD的發病可能與遺傳、環境、老齡化、免疫學異常和氧化應激等因素有關，其主要病變為中腦黑質多巴胺(DA)神經元選擇性缺失或變形，導致神經元變性死亡或神經膠質增生等〔1～3〕。激活小膠質細胞會導致如腫瘤壞死因子(TNF)-α等多種炎癥因子的釋放，引起DA能神經元損傷〔4〕。目前研究發現，PD發病機制可能與線粒體功能異常、DA氧化產生的毒性代謝產物和細胞凋亡有關，但其具體的作用機制還不明確。核苷酸寡聚結合域蛋白(NOD)是一種NOD樣受體，在多種免疫和炎癥性疾病中發揮重要作用。NOD2是NOD樣受體家族中研究的熱點〔5，6〕。有研究發現，NOD2基因可能在PD的發生中起重要作用〔7〕。本實驗以神經毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP) 制備PD小鼠模型，通過觀察NOD2基因敲除小鼠中黑質細胞凋亡情況和DA能神經元特異性標志物腦黑質酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經元數目、TNF-α蛋白、神經遞質DA含量、DA代謝產物高香草酸(HVA)含量的變化，探討NOD2基因對PD黑質DA神經元的保護作用及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 清潔級健康雄性C57BL/6小鼠20只，鼠齡6 w，體重18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。NOD2基因敲除小鼠20只，購于美國Jackson實驗室。β-肌動蛋白(actin)鼠源單抗、鼠抗TNF-α單抗、兔抗B細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2單抗、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3單抗和辣根過氧化物酶(HRP)-二抗均購于北京博奧森生物有限公司。MPTP、DA和HVA對照品均購于美國Sigma公司。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)總蛋白檢測試劑盒購于北京碧云天生物有限公司。色譜柱為美國Agilent公司產品。注射器為鎮江康利醫藥器械有限公司產品，電泳儀為美國Bio-Rad產品。

1.2動物模型制備及分組 取健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組和PD模型組。NOD2基因敲除小鼠隨機分為NOD2對照組和NOD2組。PD模型組：每日上午7時腹腔注射MPTP，共注射14 d。對照組：每日上午7時腹腔注射與MPTP等量的生理鹽水，共注射14 d。NOD2組：每日上午7時腹腔注射MPTP，共注射14 d。NOD2對照組：每日上午7時腹腔注射與MPTP等量的生理鹽水，共注射14 d。每次注射藥物后觀察小鼠的變化。

1.3行為學檢驗 建模14 d時，腹腔注射濃度為0.5 mg/ml的阿撲嗎啡，于一封閉的圓形空間內，觀察各組小鼠的旋轉行為。每只小鼠每次檢驗記錄時間為30 min。

1.4組織切片的制備 每組各取5只小鼠，用2%戊巴比妥鈉溶液深度麻醉，注射MPTP 14 d后的各組小鼠，處死并取出整個腦部，于冰上迅速分離出黑質(-80℃下保存)，置于固定液(含4%多聚甲醛)中固定24 h(4℃)，經蔗糖溶液常規脫水，包埋，切片。切片厚度8 μm。每只取4個相同切片斷面進行TH免疫組化染色。根據試劑盒說明書進行TH免疫組織化學染色。置于顯微鏡下觀察黑質區TH陽性神經元數目。

1.5黑質細胞凋亡檢測 取1.4中制備的各組組織切片，根據TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒操作步驟進行常規脫水、透明和封片。隨機選取5個視野于高倍鏡下觀察。

1.6Western印跡檢測 取適量黑質組織，加蛋白裂解液，于冰上充分研磨至勻漿，離心，取上清，于-80℃保存。采用BCA法檢測提取總蛋白的濃度。將上樣緩沖液和蛋白樣品(1∶4)充分混合，于100℃下煮沸變性5 min。以每孔30 μg蛋白樣品在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉至硝酸纖維素膜上。常溫下5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入鼠抗人β-actin、Bcl-2、酶切Caspase-3(1∶200倍稀釋)和TNF-α抗體(1∶500倍稀釋)，4℃孵育過夜，再與HRP-山羊抗兔IgG(1∶1 000倍稀釋)37 ℃下孵育2 h。化學發光法顯色，Bio-Rad系統掃描分析目的蛋白的表達量。以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示目的蛋白的表達水平。

1.7高效液相色譜熒光法測定DA和HVA含量 將剩余的每組5只小鼠，斷頸處死后，分離黑質，加甲酸，研磨成漿，在冰上裂解30 min，離心取上清。采用高效液相色譜法檢測，流動相為水(A)：甲醇(B)，流速為0.4 ml/min。柱溫為25℃，進樣量為10 μl。洗脫條件：0～4 min，5%(B)；4～10 min 5%→80%(B)；10～13 min 80%(B)；13～20 min 5%(B)。根據標準曲線計算檢測DA和HVA的含量。

1.8統計分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組行為學檢測結果 注射MPTP 14 d后，與對照組和NOD2對照組〔(0.05±0.03)、(0.03±0.01)次/min〕相比，PD模型組〔(9.88±2.05)次/min〕和NOD2組〔(5.65±1.12)次/min〕均發生不同程度的旋轉(t=8.299、8.644，均P=0.001)；且PD模型組旋轉次數顯著高于NOD2組(t=3.159,P=0.034)。

2.2各組凋亡陽性細胞數、Bcl-2蛋白表達量及酶切Caspase-3比較 TUNEL檢測結果顯示，與對照組和NOD2對照組相比，PD模型組和NOD2組凋亡陽性細胞數均明顯增多(t=12.546、6.703，P=0.000、0.003)，但NOD2組明顯少于PD模型組(t=4.983，P=0.008)。與對照組和NOD2對照組相比，PD模型組和NOD2組Bcl-2蛋白表達量均明顯下降(t=21.228、7.621，P=0.000、0.002)，但NOD2組明顯高于PD模型組(t=19.215,P=0.000)。與對照組和NOD2對照組相比，PD模型組和NOD2組酶切Caspase-3蛋白表達均顯著升高(t=26.885、8.573，P=0.000、0.001)，但NOD2組顯著低于PD模型組(t=13.856,P=0.000)。NOD2對照組與對照組相比，凋亡陽性細胞數、Bcl-2蛋白表達量和酶切Caspase-3蛋白表達量差異無統計學意義(t=0.336、1.082、1.643，P=0.754、0.340、0.176)。見表1。

表1 NOD2基因敲除對黑質細胞凋亡的影響

1)與對照組比較，2)與NOD2對照組比較，3)與PD模型組比較：均P<0.05；下表同

2.3各組TH陽性神經元、DA和HVA比較 免疫熒光染色法檢測結果顯示，與對照組和NOD2對照組相比，PD模型組和NOD2組TH陽性神經元數量均顯著降低(t=8.879、3.846，P=0.001、0.018)，但NOD2組明顯高于PD模型組(t=5.531,P=0.005)。高效液相色譜熒光法檢測結果顯示，與對照組和NOD2對照組相比，PD模型組和NOD2組中DA含量均顯著降低(t=18.573、8.509,P=0.000、0.001)，但NOD2組顯著高于PD模型組(t=15.595,P=0.000)。與對照組和NOD2對照組相比，PD模型組和NOD2組中HVA均顯著降低(t=6.758、3.621,P=0.003、0.022)，但NOD2組顯著高于PD模型組(t=5.720,P=0.005)；與對照組相比，NOD2對照組TH陽性神經元數量、DA和HVA含量差異無統計學意義(t=0.492、0.485、0.786，P=0.648、0.653、0.476)，見表2。

表2 各組TH陽性神經元數量、DA和HVA比較

2.4各組TNF-α蛋白表達比較 與對照組和NOD2對照組(0.52±0.03、0.48±0.05)相比，PD模型組和NOD2組TNF-α蛋白表達量(1.38±0.21、0.86±0.15)均明顯升高(t=7.022、4.163，P=0.002、0.014)，但NOD2組明顯低于PD模型組(t=3.490,P=0.025)。NOD2對照組與對照組差異無統計學意義(t=1.188,P=0.301)。

3 討 論

研究表明，細胞凋亡可能與PD發病機制有關，而細胞凋亡是多種基因共同調控的結果〔8～10〕。與細胞凋亡基因相關的蛋白很多，如Bcl-2家族和Caspase家族蛋白等。其中，Bcl-2是一種抑凋亡蛋白，通過改變線粒體膜的通透性阻止細胞凋亡。Xu等〔11〕研究發現，在早期的PD大鼠中，Bcl-2蛋白表達明顯下調，發揮抗凋亡作用可能參與PD的早期階段。

Caspase是一種半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，受刺激后形成Caspase級聯反應，其中Caspase-3是Caspase級聯反應的凋亡執行因子，正常情況下，以酶原形式存在，而活化后的酶切Caspase-3致不可逆性細胞凋亡。Shukla等〔12〕研究熱休克蛋白對PD果蠅模型的作用實驗中發現，熱休克蛋白能夠影響JNK和Caspase-3介導的DA能神經元細胞死亡。NOD2通過識別細菌細胞壁肽聚糖的裂解產物胞壁酰二肽，在多種疾病中發揮重要作用。Yoon等〔13〕發現活化的NOD2能夠誘導人口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡。PD的發病機制十分復雜，目前，關于NOD2基因在PD中的作用機制尚不清晰，本研究結果發現，敲除NOD2基因可明顯抑制MPTP引起的凋亡陽性細胞數、酶切Caspase-3蛋白升高和Bcl-2蛋白的下降。提示NOD2基因敲除可減輕黑質DA能神經元的調亡，減少腦內DA能神經元的缺失，進而對黑質DA能神經元發揮神經保護作用。

大量研究顯示，PD可能與炎癥密切相關，炎癥過程中小膠質細胞會產生大量活性物質如TNF-α等，引起DA能神經元死亡〔14～16〕。NOD2參與細胞內病原微生物的識別和炎癥應答，通過調控多種信號通路，在炎癥穩態和多種病理過程發揮重要作用。Du等〔17〕研究發現，NOD2在糖尿病患者腎臟的活組織和高脂飲食、鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠中表達上調，NOD2基因敲除使糖尿病晚期糖基化終末產物、TNF-α和轉化生長因子-β受到影響，進而改善糖尿病小鼠腎損傷。Bai等〔18〕通過建立腦缺血大鼠模型，下調NOD2后，通過對受體相互作用蛋白(RIP)2、核因子(NF)-κB和基質金屬蛋白酶(MMP)-9的調控在腦缺血神經功能損傷過程中發揮神經保護作用。近年來有研究發現，NOD2基因可能在PD的發生中起重要作用〔7〕。本文結果提示，NOD2基因敲除對PD模型小鼠黑質DA神經元具有一定的保護作用。

綜上，NOD2基因敲除通過抑制注射MPTP引起凋亡陽性細胞數、酶切Caspase-3蛋白和TNF-α蛋白表達升高及減輕注射MPTP引起的Bcl-2蛋白、TH陽性細胞數、DA含量和HVA含量下降，對PD小鼠DA神經元起保護作用，為PD的治療提供了新思路。