澤瀉湯加味方對高脂血癥大鼠胃黏膜AQP4蛋白表達的影響

張興芳 韓 雪 張一昕 王 茜 王亞芬 劉晨旭 王彥蕊

(河北中醫學院，河北 石家莊 050200)

高脂血癥(HLP)為臨床常見病，現代常用的治療藥物有他汀類、貝特類等，雖療效顯著，但因胃腸道不適、肝腎損傷、肌肉酸痛等副作用而限制其臨床應用〔1〕。近年來，中醫藥在防治HLP方面顯示出多途徑、多靶點、整體調節、不良反應較少的優勢。臨床研究認為脾失健運，濕聚痰生，壅滯血脈為其主要發病機制〔2〕，澤瀉湯加味方具有祛濕消痰，健運脾胃之功。水通道蛋白(AQP)4蛋白表達在水液代謝起重要作用〔3〕。 本研究旨在觀察澤瀉湯加味方對HLP大鼠血脂及APQ4的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性清潔級SD大鼠60只，體重160～180 g，由河北省實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2實驗藥物 澤瀉湯加味方組成：澤瀉50 g、白術20 g、荷葉10 g(廣東一方制藥有限公司生產的中藥配方顆粒，產品批號分別為：5073461、5063421、505037T，)將上述藥物用100℃蒸餾水充分溶解，冷卻辛伐他汀后冷藏備用。辛伐他汀片(石藥集團，生產批號：380150701，國藥準字：H20093007)，加入到0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液中攪勻，冷藏備用。

1.3實驗試劑 三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)購自中生北控生物科技股份有限公司，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)購自長春匯力生物技術有限公司，一抗AQP4兔抗IgG多克隆抗體購自美國Bioworld公司，二抗山羊抗兔、SP9001試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4實驗儀器 Humalyzer2000半自動生化分析儀(德國毫邁克公司)、TDL-5-A型離心機(上海安亭科學儀器廠)、全能顯微鏡 BX-UCB(日本 Olympus)，LEICA、RM2345石蠟切片機(萊卡上海分公司)。半干轉膜儀系統(日本ATTO公司)、紫外可見分光光度計(美國Milton roy公司)、轉移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.5方法

1.5.1實驗分組、造模、治療及樣本采集 將60只SD大鼠適應性喂養1 w后，按體重分層原則隨機分為6組，每組10只，正常組、模型組、辛伐他汀對照組(對照組)、澤瀉湯加味方高、中、低劑量組(高、中、低劑量組)。除正常組喂飼普通飼料外，其余各組均喂飼高脂飼料〔4〕(膽固醇1.5%、豬油10%、豬膽酸鈉0.5%、普通飼料88%，由河北省實驗動物中心加工)。從造模第1天起，正常組與模型組灌服蒸餾水，高、中、低劑量組分別組灌服29.56、14.78、7.39 g/kg澤瀉湯加味方，對照組灌服辛伐他汀1.89 mg/kg，1次/d，用藥體積均按 1 ml/100 g計算，共用藥治療5 w。用藥后第5周末，大鼠禁食24 h，麻醉后股動脈取血，離心，分離血清待檢。然后迅速剖取結腸，先取適當大小的結腸組織，剪開沖洗干凈后，液氮保存，以備觀察AQP4、AQP4 mRNA的表達，再取適當大小的結腸組織放于4%多聚甲醛液中固定，以備免疫組化觀察。

1.5.2血清生化指標檢測 股動脈取血，室溫靜置30 min后，4℃、3 000 r/min離心10 min，采集血清置于EP管中，用半自動生化分析儀檢測血清TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量變化。

1.5.3肝組織病理學觀察 取大小約為1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的新鮮肝組織樣本，置于4%的多聚甲醛溶液中固定，常規脫水，石蠟包埋，連續切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織的形態學變化。

1.5.4免疫組化(SP)法觀察胃黏膜AQP4的表達 將結腸組織切片，常規脫水，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7.4清洗，3%H2O2液室溫下孵育20 min，PBS清洗，0.01 mol/L pH6.0 枸櫞酸緩沖液微波爐內抗原修復30 min(92℃)，室溫下冷卻；PBS清洗，滴加山羊血清工作液封閉，37℃溫箱濕盒內孵育30 min，吸去多余血清，滴加兔抗鼠的AQP4抗體，4℃冰箱孵育過夜，PBS清洗，滴加二抗工作液，孵育30 min，PBS清洗，滴加三抗工作液，孵育30 min，PBS清洗，DAB顯色，光鏡下監視，PBS充分沖洗，終止顯色。對組織切片拍照后采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖象分析系統，在100×視野下每張切片取8個視野，測定平均光密度值作半定量分析。

1.5.5Western印跡法檢測胃黏膜AQP4蛋白表達 取大鼠胃組織約100 mg，液氮研磨，然后轉移到900 μl含有1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA溶解液中性裂解液當中，混勻，超聲裂解，配平后4℃，12 000 r/min離心 15 min，收集上清，進行蛋白含量的測定。蛋白煮沸變性以后，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次，二抗室溫孵育1.5 h，PBST洗膜3次，暗室曝光，X線膠片上顯影，用Tanon Gis軟件掃描各條帶的吸光度值并分析結果。

1.6統計方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1澤瀉湯加味方對HLP大鼠血脂的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C 的含量均明顯升高(P<0.01)，HDL-C 含量明顯降低(P<0.01或P<0.05)。藥物干預后，各用藥組TG、TC、LDL-C的含量均較模型組顯著降低，HDL-C含量均顯著升高(P<0.01或P<0.05)；與對照組相比，高劑量組血脂各項指標無明顯變化(P>0.05)，中、低劑量組TG、TC、LDL-C含量顯著升高，HDL-C含量顯著降低(P<0.01或P<0.05)；澤瀉湯加味方各劑量組之間比較，高劑量組TG、TC、LDL-C的含量顯著低于中、低劑量組(P<0.01或P<0.05)，HDL-C的含量顯著高于中、低劑量組(P<0.05)；與低劑量組相比，中劑量組TC含量顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.2澤瀉湯加味對HLP大鼠肝組織病理形態學的影響 正常組肝細胞排列整齊，形狀為規則六邊形，圍繞中央靜脈呈放射狀分布，肝血竇結構正常，無脂肪滴和炎性浸潤。模型組大鼠肝細胞排列不整齊，且出現大量脂肪滴，細胞核位置被擠壓偏離，肝血竇充血水腫。對照組肝細胞結構清晰，脂肪滴明顯減少，肝血竇充血水腫減輕，但存在細胞壞死及炎性浸潤。澤瀉湯加味方高、中、低劑量組較模型組結構排列清晰，脂肪滴也不同程度減少，肝血竇形態趨于正常，尤以高劑量組效果顯著。見圖1。

2.3免疫組化法檢測各組胃黏膜AQP4的表達情況 正常組胃黏膜上皮細胞陽性細胞表達較少，著色較淺。模型組胃黏膜上皮細胞的細胞核、胞質著色較深，表達較多，上皮細胞下方的平滑肌細胞陽性表達較少。對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組陽性細胞的表達及著色程度依次降低。半定量分析顯示：模型組大鼠胃黏膜AQP4的表達較正常組顯著升高(P<0.01)；各用藥組AQP4的表達均顯著低于模型組(P<0.01)；其中，高、中、低劑量組顯著低于對照組(P<0.01或P<0.05)；高劑量組顯著低于低劑量組(P<0.05)，與中劑量組無差異(P>0.05)；中劑量組顯著低于低劑量組(P<0.05)，見表1，圖2。

2.4Western印跡檢測各組胃黏膜AQP4蛋白的表達情況 模型組大鼠胃黏膜AQP4的表達較正常組顯著升高(P<0.01)；各用藥組AQP4的表達均顯著低于模型組(P<0.01)；其中，高、中劑量組顯著低于對照組(P<0.01)；高劑量組顯著低于低劑量組(P<0.01)，與中劑量比較差異無統計學意義(P>0.05)；中劑量組與低劑量組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表1，圖3。

表1 各組血清 TG、TC、HDL-C、LDL-C 含量及胃黏膜組織APQ4蛋白相對含量比較

與模型組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與對照組比較：3)P<0.05，4)P<0.01;與高劑量組比較：5)P<0.05，6)P<0.01；與中劑量組比較： 7)P<0.05

圖1 各組肝組織的形態變化(HE，×200)

圖2 各組胃黏膜中AQP4的表達(SP，×200)

1：正常組 2：模型組 3：對照組4：低劑量組 5：中劑量組 6：高劑量組圖3 各組胃黏膜中AQP4蛋白的表達

3 討 論

中醫中據HLP臨床表現、體征及舌脈等特點，可歸屬于“痰濁”、“血瘀”等范疇〔4〕，臨床多分為肝氣郁證、肝郁脾虛證、肝腎陰虛證、腎陽虛證、痰瘀內阻證、陰虛陽亢證等6種證型予以辨治〔5〕。該病的發生多是由飲食饑飽失節、偏嗜醇甘厚味、久坐怠惰懶動、情志抑郁失暢等致使脾運功能下降，升清降濁失職，水濕停聚成痰，痰濁停積生成“脂膏”，注入血液、壅塞血脈而誘發。痰濁是導致血脂異常的主要物質基礎，脾失健運，痰濁內生為其主要病機，健脾祛濕消痰為其有效治法。有學者對脾虛狀態下HLP大鼠的膽固醇代謝進行研究發現，因脾虛運化失常導致的HLP膽固醇水平明顯升高，且肝臟出現脂質沉積，揭示了“脾主運化”對肝臟脂質代謝的調控作用〔6〕。澤瀉湯加味方是在《金匱要略》澤瀉湯的基礎上加入荷葉而成，方中澤瀉利水道、祛水濕、消痰濁、降血脂，白術補氣健脾、燥濕利水，既健脾益氣以助運化，又祛痰濕，荷葉升清降濁，祛濕利尿，三藥同用，驅邪扶正，標本兼顧，共奏消痰祛濁，健運脾胃之功，臨床以此為基礎方劑隨證加味，獲效較佳。

AQP在20 世紀 90 年代被發現于細胞膜上具有“轉運水”的特異性通道蛋白，在人體水液代謝中發揮不可替代的作用，共有13個亞型，AQP0～12，存在于人體各個組織器官中〔7〕，AQP4 主要集中在胃體部黏膜的中部和底部，多在胃腺體主細胞膜和壁細胞膜的基側面分布表達。AQP與中醫的濕病關系密切〔8〕，為探討中醫藥在防治與水液代謝失常所致疾病的研究中提供了新的方向。目前基于AQPs途徑防治HLP的報道較少，但有關通過調控胃黏膜AQPs的表達，調節水液代謝防治脾胃疾病的報道較多。李合國等〔9〕通過檢測慢性淺表性胃炎(經中醫辨證屬于脾胃濕熱證和脾虛證)患者胃黏膜中AQP3、4的表達，認為其表達升高可能是脾失健運，水液運化失常的病理基礎。韋嵩等〔10〕通過實驗研究觀測脾胃濕熱大鼠胃黏膜組織中AQP4的表達，也認為其表達增強可能是脾胃濕熱證發生的機制之一。婁勤進等〔11〕開展了腹水草水提液對胃潰瘍大鼠胃組織中AQP4表達的影響實驗研究，認為腹水草通過降低AQP4的表達調節胃內水液代謝的平衡從而達到保護胃黏膜的作用。因此，胃黏膜AQP4的表達與水濕的生成關系密切。

本研究證實了血脂異常與胃黏膜AQP4的表達具有相關性，由于AQP4表達上調，使細胞分泌及水的跨膜轉運出現異常。經澤瀉湯加味方治療后，體內水分重吸收過度，澤瀉湯加味方是通過調控AQP4表達調節水液代謝。