柴胡疏肝丸對糖尿病合并抑郁大鼠行為學表現及認知功能的影響

彭述珊 岳 靜

(麗水市第二人民醫院精神科五病區，浙江 麗水 323000)

臨床調查顯示，糖尿病患者抑郁癥發病率為非糖尿病患者2～3倍，其中20%～30%的糖尿病患者共病抑郁癥〔1，2〕。因此，探討糖尿病合并抑郁癥的發病機制，做好防治具有重要意義〔3〕。柴胡舒肝丸是由柴胡、香附、川芎、陳皮、芍藥、枳殼、炙甘草、黨參、半夏、白芍等組成，具有疏肝解郁、行氣止痛功效，主要用于治療肝郁證的一種常用方劑。目前，臨床上對于柴胡疏肝丸用于糖尿病合并抑郁癥相關作用機制報道甚少。本研究通過建立糖尿病合并抑郁大鼠模型，探討柴胡舒肝丸對其行為學表現及認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，體重180～200 g，來自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2013-0004。柴胡疏肝丸(柴胡、香附、川芎、陳皮、芍藥、枳殼、炙甘草、黨參、半夏、白芍等組成)，鹽酸氟西汀膠囊(法國Patheon公司)。

1.2主要試劑 RIPA裂解液和Trizol試劑(Life Technolgies公司)，鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體及兔抗鼠JNK單克隆抗體(Abcam公司)。

1.3主要儀器 動物學習記憶系統(Viewpoint公司)，實時熒光定量PCR儀(Roche公司)，電泳儀(Bio-Rad公司)。

1.4糖尿病合并抑郁癥模型制備 采用14 d高脂灌胃聯合鏈脲佐菌素尾靜脈注射(38 mg/kg)造糖尿病模型，鏈脲佐菌素注射3 d后，大鼠禁食不禁水6 h，測定大鼠空腹血糖值。糖尿病模型大鼠成功標準為空腹血糖≥16.0 mmol/L。繼續給予糖尿病模型大鼠慢性不可預見性應激，條件包括禁食或禁水24 h、水浴4 min、傾籠24 h、50 V電擊3 min、潮濕墊料24 h、光照或黑暗24 h、夾尾1 min，每日采用1～2種進行刺激，同種刺激不連續出現，并且電擊、夾尾軀體應激每周限1次，共28 d。

1.5實驗分組及給藥 按照隨機表法將80只大鼠隨機分為模型組、鹽酸氟西汀組、柴胡疏肝丸組和正常組，各20只。模型組和正常組給予等劑量蒸餾水灌胃，每日1次；鹽酸氟西汀組給予鹽酸氟西汀膠囊1.8 mg/kg灌胃，每日1次；柴胡疏肝丸組給予柴胡舒肝丸1 ml/100 g灌胃，每日1次。連續灌胃28 d。末次給藥后大鼠禁食12 h，給予大鼠3 ml/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取大鼠腦，剝離海馬組織，放置于-20℃保存備用。

1.6Western印跡檢測鼠海馬JNK、Bax和Bcl-2蛋白表達 取上述海馬組織，加入細胞裂解液，放置于冰上繼續勻漿，離心10 min，取上清液制備組織蛋白提取液檢測，以β-actin作為內參，測定蛋白表達灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.7RT-PCR檢測海馬JKN、Bax和Bcl-2 mRNA表達 取上述海馬組織，加入Trizol試劑，置于冰上進行勻漿，海馬組織總RNA提取嚴格參照RNA提取步驟提取，進行反轉錄，合成cDNA。PCR擴增JNK、Bax和Bcl-2基因產物。基因表達差異數據采用2-△△Ct分析。RT-PCR引物序列：JNK上游：5′-AGGAATAGTGTGTGCAGCTTATG-3′，下游：5′-CTTCTAGGGATTTCTGTGGTGTG-3′；Bax上游：5′-GTTTCATCCAGGATCGAGC-3′，下游：5′-GATCATCCTCTGCAGCTCC-3′；Bcl-2上游：5′-TGTGTGGAGAGCGTCAACCG-3′，下游：5′-TCCACAAAGGCGTCCCAGC-3′；β-actin上游：5′-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3′，下游：5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′；反應條件95℃預變性2 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，共45個循環。

1.8行為學測試及認知功能測試

1.8.1行為學測試 ①強迫游泳實驗：將大鼠放入高為50 cm、直徑為20 cm的圓柱形水缸中，水深40 cm左右，隨機選擇大鼠，每次觀察3只，采用雙盲法檢測。實驗開始后60 s為適應時間，適應結束后記錄5 min內大鼠不動時間。②Open-field測試：采用長為80 cm、寬為80 cm、高為40 cm的一個敞箱，底面平均劃分為25個小方格。將大鼠于實驗開始后從敞箱中央放入，觀察且記錄大鼠4 min內垂直豎立次數及水平運動格數，計算垂直和水平得分的總和。

1.8.2認知功能測試 采用Morris水迷宮測試系統進行測試，包括圓形水池(直徑150 cm)、平臺(直徑10 cm、高15 cm)，平臺表面低于水面2 cm，水迷宮記錄分析系統訓練4 d。于大鼠第5天進行隱藏平臺獲得實驗，記錄潛伏期，考察認知能力。于大鼠第6天撤去平臺，進行空間搜索實驗，測試記憶能力。

1.9統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組大鼠海馬JNK、Bax和Bcl-2 mRNA表達比較 與正常組比較，其余各組Bax和JNK表達明顯升高而Bcl-2 mRNA明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸氟西汀組和柴胡疏肝丸組Bax和JNK mRNA表達明顯降低而Bcl-2表達明顯升高(P<0.05)；柴胡疏肝丸組Bax和JNK mRNA表達明顯低于鹽酸氟西汀組而Bcl-2 mRNA表達明顯高于鹽酸氟西汀組(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠海馬JNK、Bax和Bcl-2蛋白表達比較 與正常組比較，其余各組Bax和JNK蛋白表達明顯升高而Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸氟西汀組和柴胡疏肝丸組Bax和JNK蛋白表達明顯降低而Bcl-2蛋白表達明顯升高(P<0.05)；柴胡疏肝丸組Bax和JNK蛋白表達明顯低于鹽酸氟西汀組而Bcl-2蛋白表達明顯高于鹽酸氟西汀組(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠海馬JNK、Bax和Bcl-2 mRNA表達比較

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與鹽酸氟西汀組比較:3)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠海馬JNK、Bax和Bcl-2蛋白表達比較

2.3各組大鼠行為學測試比較 與正常組比較，其余各組自主活動次數明顯減少而不動時間明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸氟西汀組和柴胡疏肝丸組自主活動次數明顯增加而不動時間明顯減少(P<0.05)；柴胡疏肝丸組自主活動次數明顯多于鹽酸氟西汀組而不動時間明顯少于鹽酸氟西汀組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠行為學測試比較

2.4各組大鼠Morris水迷宮測試比較 與正常組比較，其余各組中心區域停留和穿越目標區次數明顯減少而逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；與模型組比較，鹽酸氟西汀組和柴胡疏肝丸組中心區域停留和穿越目標區次數明顯增加而逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)；柴胡疏肝丸組中心區域停留和穿越目標區次數明顯多于鹽酸氟西汀組而逃避潛伏期明顯短于鹽酸氟西汀組(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠Morris水迷宮測試比較

3 討 論

糖尿病主要是由多種引起導致的以慢性高血糖為特征的一種代謝紊亂，抑郁癥是其危害最大的慢性并發癥〔4，5〕。中醫學認為糖尿病合并抑郁癥是由于肝氣郁結、情志不舒漸引起五臟不和，化火、耗氣、瘀阻、生痰和傷陰等所致，屬“郁癥”范疇，應以疏肝理氣為主要治療法則〔6～8〕。柴胡舒肝丸是純中藥制劑，組成主要包括柴胡、香附、川芎、陳皮、芍藥、枳殼、炙甘草、黨參、半夏、白芍，其中柴胡具有疏肝解郁功效，香附具有理氣解郁功效，川芎具有活血祛瘀、行氣開郁功效，陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰功效，芍藥具有養血和營、緩急止痛功效，枳殼具有理氣寬中功效，炙甘草具有調和諸藥功效，黨參具有補中益氣、健脾功效，半夏具有燥濕化痰功效，白芍具有養血柔肝、緩中止痛功效。縱觀全方可奏疏肝理氣功效。強迫游泳實驗主要使動物處于無可回避的一個壓迫環境，一段時間后動物表現出典型的不動狀態，即處于一種行為絕望狀態，該實驗方法廣泛用于抗抑郁藥物的研究〔9〕。Open-fied實驗主要是評價動物在新異環境中自主行為、緊張度及探究行為常用的一種行為學方法。本研究表明，通過柴胡舒肝丸干預后可明顯增加糖尿病合并抑郁大鼠自主活動次數而減少大鼠不動時間。Morris水迷宮試驗主要用于實驗動物空間學習記憶能力的考察，該試驗方法廣泛應用于與大腦海馬組織病變相關神經系統疾病研究〔10〕。本研究表明，通過柴胡舒肝丸干預后可明顯增加糖尿病合并抑郁大鼠中心區域停留和穿越目標區次數及縮短逃避潛伏期。

已有研究報道顯示，在海馬神經元中JNK信號通路具有重要作用，且糖尿病和抑郁癥導致的海馬損傷都與海馬JNK信號通路異常活化及造成控制凋亡的相關蛋白異常表達相關〔11〕。在多種疾病介導的神經元凋亡中JNK激活發揮重要作用。Bcl-2是一種抗細胞凋亡因子，具有抑制細胞凋亡作用，且可通過抑制氧自由基或者抗氧化作用產生來阻止細胞凋亡，進一步阻斷細胞死亡級聯〔12〕。Bax是與Bcl-2功能相反的一種基因，具有促進細胞凋亡作用，二者平衡可決定細胞是否發生凋亡〔13〕。本研究表明，通過柴胡舒肝丸干預后可下調糖尿病合并抑郁大鼠Bax和JNK表達從而上調Bcl-2表達，而抑制海馬神經元凋亡。