一株苯酚降解菌株的篩選鑒定及特性研究

任瑞凡　劉永陽　曲文浩　孔令騰　李瀟瀟　薛智權　呂建華

摘 要：為了從焦化廢水活性污泥中篩選出高效降酚的細菌，以對廢水中苯酚進行生物處理。以苯酚為唯一碳源，從太谷縣某焦化廠活性污泥中篩選苯酚降解菌，同時通過Plackett-Burman試驗設計，結合正交試驗分析，確定該菌株降解苯酚的最佳條件，通過酶活性測定推測菌株降解途徑。結果從活性污泥中分離得到1株苯酚降解菌株B10，經分析16S rDNA序列和構建系統進化樹，初步鑒定該菌株為芽孢桿菌屬細菌。通過利用Plackett-Burman試驗設計，結合正交試驗分析，確定該菌株降解苯酚的最佳條件為：酵母膏10 g·L-1，乙醇4 g·L-1，初始接菌量2.5%，培養溫度30 ℃，硫酸鎂1 g·L-1。當以苯酚為唯一碳源時，菌株B10中僅有鄰苯二酚1， 2-雙加氧酶活性被檢測到，因此推測，該菌株通過鄰位途徑降解苯酚。結果表明，B10菌具有降解苯酚能力，對于治理含酚廢水具有應用潛力。

關鍵詞：苯酚；芽孢桿菌屬B10；Plackett-Burman試驗設計；鄰苯二酚1， 2-雙加氧酶活性

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.11.004

Study on Screening， Identification and Characterization of A Phenol-degrading Bacterium Strain

REN Ruifan， LIU Yongyang， QU Wenhao， KONG Lingteng， LI Xiaoxiao， XUE Zhiquan， LYU Jianhua

（College of Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu， Shanxi 030801，China）

Abstract： The purpose of this paper is to screen highly effective phenol-degrading bacteria from the activated sludge of coking wastewater for the treatment of phenol in wastewater. The paper took phenol as the sole carbon source， by utilizing phenol as sole carbon source， screening phenol-degrading bacteria from the active sludge of coking plant in Taigu county of Shanxi province， at the same time， the optimum conditions for degradation of phenol were determined by Plackett-Burman experimental design and orthogonal test analysis， and the degradation pathway of the strain was determined by enzyme activity detection. The results showed that a phenol-degrading bacterium strain B10 was isolated from the active sludge. Based on the analysis of the 16S rDNA sequence and the construction of the phylogenetic tree， the strain was identified as Bacillus. Utilizing the Plackett-Burman design， together with orthogonal test analysis， it was confirmed that the optimum degradation conditions of the strain were yeast extract 10 g·L-1， ethanol 4 g·L-1， inoculation volume 2.5%， temperature 30 ℃， magnesium sulphate 1 g·L-1. When phenol was the only carbon source， only catechol 1， 2-dioxygenase activity in strain B10 was detected. Therefore， it was speculated that the strain might metabolize phenol via ortho-cleavage pathway. The results showed that B10 could degrade phenol and had potential application in the treatment of phenolic wastewater.

Key words： phenol； Bacillus sp. B10； Plackett-Burman； catechol 1， 2-dioxygenase activity

苯酚及其衍生物是各種有機化合物的基本結構單元，作為原料已被廣泛應用于石油化工、醫藥、印染、造紙等行業，其工業廢水成為含酚廢水的主要來源[1-3]。研究表明，即使是極低濃度的苯酚也會使飲用水產生令人反感的味道。當酚類及其衍生物濃度在5～2 000 mg·L-1時，對所有生命體都具有強烈毒性。因此，酚類物質被確定為優先污染物[4-7]。去除工業廢水中的苯酚對環境保護具有重要的現實意義。

采用微生物降解苯酚已經進行了至少20年的嘗試。有研究表明，許多細菌和酵母菌能夠耐受和降解低濃度的苯酚，并且將酚類化合物分解代謝成無害的最終產物，因此，微生物降解是非常有效的處理含酚廢水的方法[8]。目前，國內外分離和鑒定到的降解苯酚的微生物包括細菌和真菌兩大類。其中，細菌159 種，分屬于42個屬；真菌53 種，分屬于15個屬。細菌以假單胞菌屬的菌株最多，其次是芽孢桿菌屬、產堿菌屬、紅球菌屬和不動桿屬；真菌以酵母屬最多，其次是假絲酵母屬[9]。

采用微生物降解工業廢水中的苯酚時，其降解效果會受到許多因素的影響。因此，需要從這些因素中篩選影響顯著的因素。采用單因素不能確定主要因素和次要因素，而Plackett-Burman試驗能夠從諸多因素中快速有效地篩選出最重要的因素[10-11]。

通過對山西農業大學所在地太谷縣某焦化廠廢水池中的活性污泥進行采集，采用初篩、復篩的方法篩選出高效降酚的細菌，并通過Plackett - Burman試驗篩選影響菌降解苯酚的重要因素，利用正交設計對重要因素進一步優化，以篩選出影響菌株苯酚降解率的最佳相關因素，同時對苯酚降解酶活性進行測定，旨在為含酚廢水的治理提供重要的理論和實際應用價值。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 研究所用樣品采自于山西省晉中市太谷縣某焦化廠廢水處理池中的活性污泥，污泥裝入滅菌后的三角瓶中封好，放4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養基 （1）富集培養基。 牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，調pH值為7.0，加水定容，高壓蒸汽滅菌，121 ℃，滅菌20 min，冷卻后加入兩性霉素0.002 5 g·L-1，苯酚1 g·L-1。（2）無機鹽篩選培養基。 K2HPO4 0.4 g·L-1，KH2PO4 0.2 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，MgSO4 0.1 g·L-1，MnSO4·H2O 0.01 g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.01 g·L-1，酵母提取物2.5 g·L-1，瓊脂粉15～20 g·L-1，加水定容，高壓蒸汽滅菌，121 ℃，滅菌20 min，冷卻后加入兩性霉素0.002 5 g·L-1，苯酚根據需要量加入。

1.1.3 試劑 試驗所用化學試劑均為分析純，酵母提取物購自OXOID公司，細菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，PCR試劑購自北京康為世紀有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 苯酚含量的測定 采用4-氨基安替比林法[12]測定苯酚含量，略有改進。將培養液于12 000 r·min-1離心1 min后，取上清30 μL加入到10 mL試管中，加蒸餾水到4 mL，加入40 μL pH值為10的氨水緩沖溶液，加80 μL 2%的4-氨基安替比林，混勻，再加入80 μL 8%的鐵氰化鉀溶液，混勻，15 min后，在510 nm處測吸光度。

1.2.2 降酚菌株的分離與純化 配制100 mL的富集培養基，高壓滅菌后加入終濃度0.002 5 g·L-1的兩性霉素溶液和終濃度1 g·L-1苯酚溶液混勻，挑取采集的污泥樣品接種到培養基中，置于28 ℃，180 r·min-1的搖床上振蕩培養2 d。將富集培養液梯度稀釋101，102，103，104，105倍，然后分別取104和105倍稀釋液100 μL 接種到苯酚濃度（m/V）為1.5，2.0，2.5 ，3.0 g·L-1無機鹽固體培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養7 d。挑取無機鹽固體培養基上生長的不同形態的單菌落，接種于富集培養基中，于28 ℃，180 r·min-1的搖床上振蕩培養16 h后，按照5%的接種量接種于苯酚濃度為1 g·L-1的無機鹽液體培養基中，并且按照同樣的方法，用水代替菌液作陰性對照，置于28 ℃，180 r·min-1的搖床上培養。然后在24 h時使用4-氨基安替比林分光光度法測定苯酚濃度，計算苯酚降解率，篩選出苯酚降解率高的菌株用于后續試驗。

苯酚降解率=（未接菌前培養液苯酚量-培養結束培養液殘余苯酚量）/未接菌前培養液苯酚量×100%

1.2.3 降酚菌株的分子和形態特征鑒定 取1 mL菌株培養液，10 000 r·min-1，離心1 min，盡量吸掉上清液，根據細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取菌株基因組DNA。16S rDNA采用細菌通用引物27F（5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3）及1492R （5-GGTTACCTT GTTACGACTT-3）進行擴增，PCR體系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2 μL dNTP mix（2.5 mmol·L-1），0.5 μL 27F（10 μmol·L-1），0.5 μL 1492R（10 μmol·L-1），3 μL 細菌基因組DNA，水16 μL，0.5 μL Taq DNA聚合酶。PCR程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物由北京華大基因有限公司進行純化測序。然后，通過BLAST與NCBI數據庫序列進行比對，并通過MEGA 5.0軟件采用鄰接法構建系統進化樹。

菌體形態特征鑒定通過采用結晶紫和碘液先后染色，乙醇脫色，番紅復染的方法對菌株進行革蘭氏染色，采用Olympus DP71高倍顯微鏡觀察菌體結構特征。

1.2.4 降酚菌株降解特性的優化 試驗以苯酚降解率為響應目標，采用Plackett-Burman試驗設計，選取溫度、pH值、搖床轉數、初始接菌量、苯酚初始濃度、葡萄糖、甲醇、乙醇、酵母膏、硫酸銨、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸錳、氯化鐵、氯化鈉、硫酸鎂16個模擬工業廢水中對菌株降解苯酚具有影響的相關因素進行設計，通過回歸分析，比較各個因素兩水平的差異與整體的差異來確定因素的顯著性，從而得到對菌株降解苯酚有顯著影響的因素，再用正交試驗進一步優化菌株最佳降解條件，并進行驗證。用Minitab 15軟件設計試驗并進行數據處理。

1.2.5 不同濃度苯酚對降酚菌株生長的影響 將純化的菌株再次接種到以苯酚為唯一碳源，濃度分別為1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，

2.5 g·L-1的無機鹽固體培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養7 d，以確定菌株耐受的最高苯酚濃度。

1.2.6 粗酶液的提取 將篩選出的菌株接種到富集培養基中，培養24 h后接種到以1 g·L-1苯酚為唯一碳源的液體無機鹽培養基中，30 ℃，180 r·min-1振蕩培養，取對數生長期后期菌液10 mL，4 ℃，12 000 r·min-1高速離心5 min，收集菌體，上清液留取待用，菌體用pH值為6.8磷酸鹽緩沖液清洗2次，然后用磷酸鹽緩沖液重懸細胞，加入終濃度為10 mg·mL-1的蛋白酶K，用SCIENTZ98-III杯式超聲破碎儀破碎細胞， 超聲破碎30 s，間隔25 s，連續超聲45 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心20 min，收集上清液即為粗酶液[13]。

1.2.7 酶活的測定 （1）苯酚羥化酶活力測定。苯酚羥化酶活力嚴格依賴于NADPH的存在，NADPH在340 nm處有吸收，通過在波長340 nm處測定NADPH的減少速度來表示。一個單位（U）的苯酚羥化酶活性被定義為每毫克蛋白每分鐘氧化1 μmol NADPH所需的酶量。酶活測定參照文獻[14]進行檢測。（2）鄰苯二酚-1， 2-加氧酶（C12O）活力測定。以單位時間內反應產物（粘糠酸）在260 nm處吸光度變化表示。（3）鄰苯二酚-2， 3 加氧酶活力測定。以單位時間內反應產物（2-羥基粘糠酸半醛）在375 nm處吸光度變化表示。一個單位（U）的鄰苯二酚1，2（或2，3）雙加氧酶活性被定義為每毫克蛋白每分鐘產生1 μmol黏糠酸（或2-羥基黏糠酸半醛）所需的酶量[15]。雙加氧酶活性測定參照文獻[16]進行檢測，以磷酸鹽緩沖液為參比。總蛋白含量用Bradford 法測定[17]。酶的比活力以每毫克的蛋白質中所含酶的活力單位數計算。

酶的比活力=（ （ΔAs-ΔAb）·V）/（ [ε·d·ΔT·mg （protein）]） 式中，ΔAs表示樣品吸光度的變化值；ΔAb表示空白對照吸光度的變化值；V表示反應體系總體積；ε表示摩爾吸光系數；ΔT表示反應時間。ε340 = 6 220 L·（mol-1·cm-1），ε260 = 16 800 L·（mol-1·cm-1），ε375 = 44 700 L·（mol-1·cm-1）。

2 結果與分析

2.1 降解苯酚細菌的篩選和鑒定

經過初篩和復篩，獲得13種苯酚降解細菌，分別編號B1～B13。將13株菌進行苯酚降解率測定，得到1株降解率最高的菌株，菌株在苯酚濃度為1 g·L-1時的無機鹽液體培養基中，經28 ℃，180 r·min-1培養24 h，可使苯酚降解率達到47.9%。提取菌株基因組DNA后，通過細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增并測序，得到長度為1 447 bp的擴增產物，序列（GenBank登錄號：MG738215.1）經BLAST與NCBI 數據庫中登錄的序列比對分析，結果表明，它與Bacillus sp. KT981880.1序列有99%相似性，初步鑒定該菌株為Bacillus屬細菌，命名為Bacillus sp. B10。菌株的系統進化樹如圖1所示。經革蘭氏染色確定該菌株為革蘭氏陽性菌，菌落形態呈桿狀，并且有芽孢生成，結果如圖2所示。

2.2 Plackett-Burman設計篩選降解苯酚重要因素

采用試驗次數N=16的Plackett-Burman試驗設計對模擬工業廢水中影響菌株Bacillus sp. B10苯酚降解率的16個因素進行研究，每組重復3次。試驗設計及結果如表1所示，各因素主效應分析如表2所示，應用Minitab軟件分析模型的P=0.046，說明試驗結果可信。苯酚降解率回歸分析復相關系數為0.980 2，調整后為0.874 6，說明數據對模型的擬合度較好。根據主效應分析結果，將置信度高于90%的因素作為進一步優化的因素，可知影響B10菌降解苯酚的顯著性因素依次為酵母膏、初始接菌量、硫酸鎂、培養溫度和乙醇，而其他因素對菌B10的苯酚降解率沒有顯著影響。

2.3 正交優化試驗設計

根據Plackett-Burman試驗設計結果，本試驗選擇可信度大于90%以上的因素作為重要因素，因此選擇酵母膏（L）、初始接菌量（D）、硫酸鎂（T）、溫度（A）和乙（J）5個因素，進行5因素4水平正交設計，選用L16（45 ）正交試驗表進行。正交試驗設計因素水平表及結果如表3所示。方差分析如表4所示。

由極差分析結果可知，對B10菌苯酚降解率影響的因素次序為乙醇>酵母膏>初始接菌量>溫度>硫酸鎂；方差分析結果表明，酵母膏、乙醇和初始接菌量為顯著影響因素，溫度和硫酸鎂影響不顯著。因此，可確定影響B10菌苯酚降解率的最佳條件為：酵母膏10 g·L-1，乙醇4 g·L-1，初始接菌量2.5%，培養溫度30 ℃，硫酸鎂1 g·L-1。

2.4 不同濃度苯酚對降酚菌株生長的影響

將菌株分別接種于以1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，

2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5 g·L-1苯酚為唯一碳源的無機鹽固體培養基上，28 ℃恒溫培養箱培養7 d后觀察發現，該菌株在苯酚濃度為2.3 g·L-1及其以下濃度的無機鹽固體培養基上均有菌落生長，而在苯酚濃度為2.4～2.5 g·L-1上均無菌落生長。說明該菌株最大苯酚耐受濃度為2.3 g·L-1。

2.5 菌株苯酚代謝途徑分析

通過測定B10菌株粗酶液中苯酚羥化酶、鄰苯二酚1，2-加氧酶和鄰苯二酚2，3-加氧酶的活性，初步判斷該菌株降解苯酚途徑。在以苯酚為唯一碳源的無機鹽培養液中，菌體粗酶液中苯酚羥化酶的比活力為（0.030 9±0.017 5）U·mg-1蛋白質，未破碎細胞上清液中苯酚羥化酶比活力為（0.093 8±0.002 1）U·mg-1，表明該酶可能為胞外酶，但尚有待進一步驗證。鄰苯二酚1， 2-加氧酶的比活力為（0.062 6±0.011 7）U·mg-1蛋白質，而鄰苯二酚2， 3-加氧酶的活性未檢測到，因此，推斷該菌株降解苯酚以鄰位開環降解為主。菌體破碎后上清液中鄰苯二酚1， 2-雙加氧酶的活性遠高于未破碎菌體上清液中酶活性，表明該酶為胞內酶。