胃癌細胞中NDRG2的表達及誘導分化研究*

常曉靜, 周歡娣, 薛曉英, 李彥格, 張歌, 楊玉, 王立文

050000 石家莊，河北醫科大學第二醫院 放療科

NDRG2(N-myc downstream regulated gene 2)是我國第四軍醫大學發現的一種與細胞分化相關的基因，屬于NDRG家族，該家族包括4個成員，即NDRG1～4，各成員間57%～65%的氨基酸具有同源性[1]。NDRG2基因定位于人染色體14q11.2，編碼的蛋白含357個氨基酸殘基，分子量約為41kDa，在人體多種組織中均有表達，不同程度地參與細胞生長發育及分化成熟等過程[2-4]。近年的研究報道，NDRG2在多種腫瘤組織中表達下調，甚至不表達，發揮特定的抑癌作用[5-7]。目前誘導分化治療已成功運用于白血病，作為一種分化相關基因，NDRG2與胃癌的關系尚缺乏研究。本研究重在探討NDRG2在胃癌細胞中的表達及其與細胞分化的關系，為胃癌的分化治療提供新的依據。

1 材料和方法

1.1 材料

胃永生化粘膜上皮細胞GES1及6株胃癌細胞SGC7901、MGC803、MKN45、BGC823、AGS和HGC27均購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物研究所。采用Invitrogen 公司的TRizol試劑提取總RNA，采用Fermentas公司的RT-PCR逆轉錄試劑盒及 DreamTaq DNA聚合酶行2步法RT-PCR。 RPMI 1640購自GibcoBRL公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司。BCA試劑盒、ECL發光劑及TPA試劑購自上海碧云天生物公司。Matrigel膠購自美國BD 公司，Transwell小室購自美國Corning公司，引物由上海華大公司合成。

1.2 細胞培養

人胃永生化粘膜上皮細胞GES1和胃癌細胞株SGC7901、MGC803、MKN45、BGC823、AGS和HGC27，單層貼壁生長于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中， 37℃，5%CO2培養箱中培養，隔天換液，取對數生長期細胞進行試驗。

1.3 TPA處理

胃癌細胞株HGC27以5×105接種于6孔板，含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，37℃，5%CO2培養箱中培養過夜。TPA以10、50、100nmol/L培養3天，對照組為不加TPA的1640培養液培養。

1.4 細胞RNA提取及RT-PCR

TRIzol提取液裂解細胞，按TRIzol試劑盒說明書提取細胞RNA。RNA沉淀溶解于30ul DEPC水中，紫外分光光度法定量。NDRG2引物：上游5’-GCCCAGCGATCCTTACCTACC-3’，下游5’-GGCTGCCCAATCCATCCAACC-3’，365bp; GADPH引物：上游5’-CCA CCCATGGCAAATTCCCATGGCA-3’，下游 5’-TCTAGACGGCAGGTCA GGTCCACC-3’ ，597bp 。RT-PCR擴增體系：5×Buffer 5uL，dNTP 5uL，Taq酶0.25uL,上下游引物各1uL，cDNA 2uL，加DEPC至25uL。擴增條件：95℃ 5min預變性，95℃ 30s， 59℃30s， 72℃ 30s，30個循環，72℃ 5min延伸。取5uL PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳，紫外投射儀下觀察結果。

1.5 Western blot

提取細胞沉淀，在細胞沉淀中加入200μL蛋白裂解液，震蕩搖勻，冰上靜置30min，12 000g 離心30min，提取上清并用BCA試劑盒(碧云天，上海，中國)測定蛋白濃度，取60ug蛋白與上樣緩沖液混合(1:4)，煮沸5min變性；將變性蛋白加入10%SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離轉膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2h，兔多克隆抗體NDRG1(1:1000，Cell Signaling公司，美國)封膜，4℃過夜，鼠抗人GAPDH一抗(1:1000)作為內參照；TBST洗，5min，3次，加相應二抗，室溫搖床上孵育2h，ECL發光，照相，quantity one軟件定量分析。

1.6 侵襲實驗(Transwell assay)

BD基質膠以含1%胎牛血清RPMI1640將其調整濃度為1：15，用力吹打混勻，取50μL置于預冷的transwell小室上層，待其均勻平整后，室溫5min后置于37℃培養箱中晾干。8小時后待基質膠徹底凝固，取出備用。將100nmol/L TPA培養72小時后的HGC27細胞與未處理的HGC27細胞常規胰酶消化，離心，調整密度為5×104定容于200μL含1%胎牛血清RPMI1640培養液中，接種于小室上層。小室下層置含20%胎牛血清RPMI1640培養液500μL，放入培養箱繼續培養。24小時后，取出小室，用棉棒擦除小室上層未穿膜的細胞，置于預先配制好的甲醇、冰乙酸(3:1)固定液中30min，取出晾干，吉姆薩染色8min，自來水輕輕沖洗，晾干，顯微鏡觀察照相計數，每孔任意選取3個200×視野拍照，計數侵襲細胞數量取其平均值進行分析。

1.7 統計學處理

結果分析均采用SPSS17.0統計軟件，均數±標準差表示。組間差異采用one-way ANOVA分析，P<0.05為差異具有顯著性。

2 結 果

2.1 NDRG2在不同分化程度胃癌細胞株中的表達

我們采用RT-PCR及Western blot檢測NDRG2在胃永生化粘膜上皮細胞GES1及6株不同分化程度的胃癌細胞中mRNA及蛋白的表達情況。結果顯示，與胃永生化粘膜上皮細胞GES1相比，NDRG2 的mRNA水平在6株胃癌細胞中呈不同程度的表達下調(圖1A)，即SGC7901(0.406±0.018)，MGC803(0.361±0.009)，MKN45(0.307±0.008), BGC823(0.654±0.024), AGS(0.123±0.002)和HGC27(0.10±0.002)，其中HGC27細胞的表達最低(P<0.05)(圖1B)。Western blot 結果進一步驗證發現，NDRG2在GES1和6株胃癌細胞系中的蛋白表達水平與mRNA水平相一致(圖1C,D)。

圖1.NDRG2在胃永生化粘膜上皮細胞GES1，以及胃癌細胞系SGC7901、MGC803、BGC823、MKN45、AGS和HGC27中的表達情況

A和C分別為各細胞中mRNA和蛋白質的表達情況。B和D分別為NDRG2 mRNA及蛋白表達的柱狀圖。GAPDH為內參照。NDRG2在GES1中表達最強，在HGC27胃癌細胞系中表達最低。*P<0.05**P<0.01

Figure1.NDRG2LevelsinHumanGastricCancerCells(SGC7901,MGC803,BGC823,MKN45AGSandHGC27)andOneImmortalizedNormalGastricCellLine(GES1)

Protein (C) and mRNA (A) levels of NDRG2 in each cell line were showed, with GAPDH as control. B, D: The histogram showed that NDRG2 in GES1 was higher than that in 6 gastric cancer cell lines, and it was in the lowest level in HGC27.*Pvalue<0.05,**Pvalue<0.01.

2.2 分化誘導劑TPA處理后NDRG2表達上調

選擇NDRG2表達最低的未分化胃癌細胞株HGC27，經不同濃度的分化誘導劑TPA處理72h后，NDRG2表達隨TPA濃度變化不同程度的上調(圖2A)，相對含量分別為對照組(0.197±0.012)，10nmol/L TPA組的(0.330±0.014)，50nmol/L TPA組的(0.435±0.006)，100nmol/L TPA組的(0.747±0.011)，差異有統計學意義(P<0.05)(圖2B)。

圖2.HGC27細胞經分化誘導劑TPA處理后NDRG2的表達情況

A和B分別為NDRG2的蛋白表達情況及表達柱狀圖。100umol/L的TPA處理組NDRG2表達最強。*P<0.05

Figure2.TheProteinLevelofNDRG2inHumanGastricCancerCell(HGC27)afterTreatmentwithTPA

NDRG2 was gradually up-regulated as the concentration of TPA increased, and it was in the highest level in the 100 umol/L group.*Pvalue<0.05

2.3 分化誘導劑TPA誘導NDRG2表達上調后可抑制胃癌細胞的侵襲

我們進一步采用Transwell 細胞侵襲實驗分析經分化誘導劑TPA處理誘導NDRG2表達上調后胃癌細胞的侵襲能力。結果顯示，100nmol/L TPA處理HGC27細胞72h后，顯微鏡下觀察，穿過Transwell小室的胃癌細胞數較對照組明顯減少(P<0.05)(圖3A,B)。這提示NDRG2高表達可明顯減弱胃癌細胞株HGC27的侵襲能力。

圖3TPA處理后HGC27細胞的侵襲力情況

分化誘導劑TPA處理后， HGC27細胞的侵襲明顯減弱，A：Transwell結果顯示經TPA處理后, HGC27胃癌細胞數較對照組明顯減少；B：顯微鏡下計數TPA處理組及對照組穿過Transwell小室的胃癌細胞數。*P<0.05

Figure3.TheinvasionofHGC27cellswasinhibitedaftertreatmentwithTPA

A: Result of Transwell showed that the number of cells decreased in the TPA group compared with those in the control group. B: The columns indicated the number of invaded cells which were counted under the microscope.*Pvalue<0.05

3 討 論

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，居所有癌癥死因第三位，主要發生在東亞，尤其是我國[8]。近年來，隨著胃癌早診率的提高、手術技術的不斷改進及新輔助化療的應用，患者的生存率得到一定程度改善，但目前死亡率仍居高不下，且發病呈年輕化趨勢，而組織學類型呈低分化趨勢。逆轉分化并抑制癌細胞轉移將是腫瘤治療的一個重要研究方向，且目前已成功應用于白血病的治療。

NDRG2是新近發現的一種細胞分化相關基因，在中樞神經系統大腦皮質、唾液上皮組織及肌肉組織等正常組織中表達，不同程度參與細胞的生長發育及分化成熟[2-3]。研究報道NDRG2在多種腫瘤組織，如結腸癌、乳腺癌、肝癌等中無表達或低表達，與患者預后呈正相關，誘導其表達上調可抑制癌細胞的浸潤、轉移，被認為是一種候選的抑癌基因[9-10]。研究發現，NDRG2通過調控c-Myc、CD24、MMPs等參與P53誘導的細胞凋亡而抑制癌細胞轉移[11-13]。目前NDRG2在胃癌中的表達及與胃癌細胞分化的關系尚缺乏研究。同家族成員NDRG1研究較為成熟，其在多種腫瘤組織中呈低或無表達，分化誘導劑如丁本酸、佛波酯(TPA)等可以誘導其表達，逆轉癌細胞惡性表型[14-15]。已有研究發現NDRG1可以促進白血病細胞的分化，逆轉細胞惡性表型，不同程度改善白血病患者預后，這為腫瘤的分化治療帶來了新的希望[16]。我們的前期研究也顯示，同家族成員NDRG1基因在胃癌細胞及組織中低表達，與組織學分化及預后密切相關，分化誘導劑TPA可以上調NDRG1表達及逆轉惡性生物學行為[17]。同屬于NDRG家族成員，NDRG2與NDRG1約有60%的氨基酸同源性，這也提示NDRG2可能同樣參與細胞的分化成熟，分化誘導劑可能逆轉其在癌細胞中的表達及惡性表型。

Choi等[18]的研究顯示NDRG2在胃癌細胞及組織中均表達下調，與胃癌患者的預后呈正相關，NDRG2表達陰性者預后較差。Ling等[19]的研究也得到相似的結果，進一步研究發現NDRG2啟動子區DNA高甲基化導致其在胃癌中的表達下調。本實驗選取胃永生化黏膜上皮細胞GES1及6種不同分化程度的胃癌細胞株檢測NDRG2基因的表達及與細胞分化的關系，結果顯示與胃永生化粘膜上皮細胞GES1相比，NDRG2基因的 mRNA與蛋白水平在6株胃癌細胞中均有不同程度的表達下調，中分化胃癌細胞株SGC7901 及低分化胃癌細胞株BGC823中相對高表達，低分化胃癌細胞株MKN45、MGC803和AGS細胞中呈中度表達，未分化胃癌細胞株HGC27中表達最低。這進一步支持NDRG2是胃癌中一種候選的抑癌基因，同時也與朱瑞雪等[20]的研究結果相一致，他們發現NDRG2在胃癌組織中表達下調，且與組織學分化程度呈正相關，這提示NDRG2可能參與細胞分化成熟，參與維持胃黏膜上皮細胞的正常分化狀態，其表達下調或沉默導致細胞去分化，惡性程度升高，促進癌細胞的轉移，導致差的預后。

TPA(12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，簡稱佛波酯)是一種很強的分化誘導劑，研究發現低濃度的TPA不僅對小鼠和人的白血病細胞具有很強的誘導分化作用，而且能使白血病細胞去分化，出現一系列形態、功能方面的變化及某些生理生化特征的變化[21]。隨后我們采用分化誘導劑TPA處理未分化的胃癌細胞株HGC27，結果顯示NDRG2隨TPA濃度的升高其表達逐漸上調，100nmol/L組表達最高。而100nmol/L的TPA處理胃癌細胞系HGC27后，細胞侵襲實驗顯示胃癌細胞的侵襲力明顯減弱。這進一步證實NDRG2與細胞分化相關，分化誘導劑可以逆轉NDRG2表達及胃癌的惡性表型，為胃癌的臨床治療提供了新的方向和依據。

綜上所述，NDRG2在胃癌細胞中表達明顯下調，是胃癌中一種候選的腫瘤抑制基因，在胃癌的發生發展中起著重要作用，而其在胃癌細胞株中的表達與細胞分化呈正相關，分化誘導劑可逆轉NDRG2的表達及惡性生物學行為。下一步我們將進行體內實驗進一步驗證NDRG2與細胞分化的關系，為胃癌的分化治療提供新的依據。

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