Slit/Robo信號通路在腫瘤發生發展中的作用

梁剛，馬清涌，王智翔，何盟國，鄭康，譚棟，沈乃營

1陜西省核工業215醫院普通外二科，陜西 咸陽 712000

2西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科，西安 710061

神經導向因子Slit家族是一類分泌型糖蛋白，可通過結合神經細胞膜上的Roundabout（Robo）受體家族發揮生物學功能。研究發現，Slit/Robo信號通路除了參與神經軸突導向作用外，還在膿毒血癥時保護血管的完整[1]、白細胞趨化性反應、血管生成及損傷[2-4]、心血管系統的形成[5]、腫瘤的發生與發展[6-7]等方面發揮生物活性。本文就Slit/Robo信號通路與腫瘤發生、發展的關系作一綜述。

1 Slit/Robo信號通路概述

Slit蛋白家族由Slit1、Slit2、Slit3組成，除在神經組織中表達外，在腫瘤細胞、白細胞、肺臟、腎臟、黃體等多種非神經組織中也有表達。Slit結構蛋白由1個N-末端信號肽、4個富含亮氨酸的重復序列（leucine-rich repeat，LRR，即D1-D4）、7～9個表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣的重復序列、1個半胱氨酸富有區C末端序列和1個層黏連蛋白G樣結構域5個部分組成。其中，LRR是Slit蛋白與其受體Robo結合必需的區域。目前已有研究證實，Slit2蛋白水解后可產生1個N末端片段（Slit2-N）和1個C末端片段（Slit2-C）。Slit2-N端包含1個N-末端信號肽、4個LRR和5個EGF樣的重復序列，分子量為140 kD；Slit2-C端則由剩下的部分組成，分子量為55～60 kD。

Robo家族是一類保守跨膜受體蛋白，由4個成員組成，包括Robo1、Robo2、Robo3和Robo4，主要表達于神經系統，也可以表達于非神經系統，如血管內皮細胞、肌細胞等。Robo1、Robo2和Robo3由含有5個免疫球蛋白（Ig）結構域樣功能區及3個Ⅲ型纖連蛋白（fibronectin typeⅢ，FN3）組件的胞外區、1個跨膜區和1個胞內區組成。胞內區域含有CC0、CC1、CC2、CC3四個小的區域。Robo4胞外區域只含2個Ig樣功能區以及3個Ⅲ型纖連蛋白重復序列；胞內區域只含有CC0和CC2區域。Robo的胞內區域通過與細胞內某些活性物質結合，參與傳導生物學信息。

在Slit/Robo信號通路中，配體和受體的穩定結合是通過Slit-N端的LRR尤其是Slit D2，與Robo胞外的Ig通過高度保守的靜電作用及非親水區域相結合。在硫酸類肝素（heparan sulfate，HS）蛋白多聚糖的參與下，Slit主要通過第2個LRR（D2）和Robo胞外前兩個免疫球蛋白結構域樣功能區（Ig1、Ig2）結合，激活Robo受體胞內區域，使其與下游效應物質如 Rho GTPases、Abl、Ena、ERK1/2、Vilse等相互作用，發揮復雜的生物學功能。需要指出的是，Robo1、Robo2、Robo3可以利用Ig1功能區與Slit2結合，而Robo4缺乏與Slit2結合的關鍵位點。

2 Slit/Robo信號在腫瘤中的表達

目前，Slit、Robo在多種腫瘤中均有表達，但其表達情況存在差異。在腫瘤表達升高方面，Wang等[8]研究發現，Slit2在鱗狀胃癌、肝癌、惡性黑色素瘤、直腸黏液腺瘤等常見腫瘤中均有表達。Slit2在惡性黑色素瘤系A375細胞中表達上調，而Robo1則在腫瘤血管內皮細胞中表達，推測腫瘤細胞分泌蛋白Slit2與血管內皮細胞分泌的Robo1以旁分泌的方式參與惡性黑色素瘤的發生。在直腸癌腫瘤細胞中，Robo1的表達水平明顯上調，而Robo4和Slit2的表達無明顯變化，但Robo4基因的表達水平在腫瘤血管內皮細胞中明顯上調，因此，Robo蛋白可能成為對抗腫瘤生成及腫瘤血管產生的潛在治療靶點[9]。在乳腺癌中，Schmid等[10]檢測出Robo1呈現高表達，Slit2能夠誘導表達Robo1的腫瘤細胞發生腦轉移。

在腫瘤表達下降方面，有研究顯示，Slit、Robo基因在許多惡性腫瘤中表達下調。Slit可以通過結合其受體Robo調節多種由趨化因子誘導的體細胞的遷移，但是這些基因在人類的許多腫瘤中由于啟動子的甲基化而滅活[11-13]。Narayan等[14]認為Slit、Robo基因的修飾變化在宮頸癌的發生、發展中具有重要作用，Slit、Robo基因常常表現出高度頻繁的啟動子甲基化，而導致它們在侵襲性宮頸癌中的表達量減少。但是在宮頸癌細胞系中，用DNA甲基化抑制因子和組蛋白去乙酰化酶不能有效地再活化Slit、Robo基因。在鼠類的乳腺癌細胞中，Slit或其受體Robo缺失時常常伴隨著SDF1和CXCR4的表達上調，還可出現周圍間質細胞的病理性增生肥大和結締組織的增生。在乳腺癌組織中，同樣表現出Slit和CXCR4表達相反的情況。在異種移植動物模型中，Slit的過表達可以下調CXCR4，同時抑制腫瘤細胞的增殖。這些現象均表明Slit可以作為SDF1和CXCR4的負性調節因子，從而參與乳腺癌的進展過程[15]。

即使在同一個腫瘤中，Slit和Robo的表達也有差別。Avci等[16]采用基因檢測的方法，發現Slit和Robo基因在肝細胞系及肝癌組織中表現出兩種表達 模 式 ，一 種 是 Robo1、Robo2、Slit1；一 種 是Robo4、Slit2、Slit3。Robo1、Robo2表達明顯上調，但Slit3在有高甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）時表達明顯下降。與正常肝臟組織相比，Robo1在腫瘤組織中表達升高，而Robo4在腫瘤組織中表達下降。

Slit和Robo在上述組織中差異性的表達，說明了Slit/Robo信號通路具有復雜性，這與Slit/Robo信號通路不同配體、受體之間的相互作用以及機制的不同有關，需要進一步深入研究。

3 Slit/Robo信號對腫瘤新生血管的作用

腫瘤新生血管的形成對腫瘤的發生、發展及轉移都具有很大的促進作用。目前已發現在血管內皮細胞中存在Robo1、Robo4兩種受體，在Slit/Robo信號通路中，它們對血管內皮細胞的作用不同，進而影響新生血管的形成。

在促進腫瘤新生血管生成方面，Wang等[8]研究發現，人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）存在著Robo1受體，腫瘤細胞分泌的Slit2可以與其結合，吸引HUVEC向腫瘤遷移，誘導腫瘤新生血管形成。但是，應用Robo1的細胞外片段或Robo1抗體對Slit2進行預處理后，HUVEC則無遷移現象。通過阻斷Slit2/Robo1信號通路可以抑制倉鼠頰黏膜鱗狀細胞癌動物模型中腫瘤新生血管的形成，因此，針對Slit/Robo的靶向治療可成為口腔癌抗腫瘤新生血管生成治療的一個新方向[17]。Slit2結合Robo1可以促進淋巴內皮細胞遷移和管樣結構形成，其作用可被功能性抗體R5阻斷，因此，Yang等[18]推測Slit2是一個有潛力的淋巴血管生長因子。

在抑制腫瘤新生血管形成方面，目前研究認為，Robo4是內皮細胞特異性基因，在人微血管內皮 細 胞（human microvascular endothelial cell，HMVEC）及HUVEC中均有表達，具有抑制內皮細胞遷移的功能。Seth等[19]在黑色素瘤、腎癌、肺癌、肝癌等惡性腫瘤血管內皮細胞中檢測到Robo4的表達，并發現Robo4被Slit2激活后，可抑制由血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）誘導的細胞遷移作用，而這種抑制作用是通過Ras-Raf-Mek-Erk信號通路所介導的。Stella等[20]研究發現，Slit2/Robo1信號通路能夠抑制運動因子誘導的內皮細胞遷移。通過siRNA滅活Slit2基因或使Robo基因異常表達，可以促進肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）誘導的內皮細胞遷移、侵襲和血管生成，并上調細胞分裂周期蛋白Cdc42的表達和降低Rac-1的活性。而當細胞Slit2蛋白主動分泌增強或外源性加入Slit2蛋白時，可以抑制HGF觸發的細胞能動反應，降低Cdc42的活性，激活Rac-1。

Enomoto等[21]對Robo1、Robo4的研究發現，在Robo4基因敲除的情況下，Slit2可以誘導HUVEC遷移，而這種作用在Robo1缺失的情況下消失，說明了Slit2/Robo1可以誘導血管的生成，Slit2/Robo4則負性調節血管的生成。Sheldon等[22]通過免疫共沉淀測定發現Robo1、Robo4可形成異二聚體，通過協同作用調節HUVEC肌動蛋白細胞骨架，調控細胞遷移。筆者設想，Slit/Robo信號通路在腫瘤血管生成的過程中主要有Slit2/Robo1和Slit2/Robo4兩個亞通路參與，前者誘導腫瘤血管生成，后者的作用相反，這兩個亞通路在某一段時期會以其中一條亞通路的作用為主，與血管周圍環境保持著動態平衡，進而維持血管的生成。另外，Zhang等[23]研究發現，Slit3分泌和表達于血管內皮細胞及平滑肌細胞，以旁分泌或自分泌形式通過結合Robo4刺激內皮細胞增殖，促進內皮細胞運動，從而調節血管內皮細胞遷移，因此，認為Slit3是一個新型的血管生長因子。

總之，Slit/Robo信號與腫瘤血管的作用及機制復雜，在不同的微環境下，Slit/Robo信號對血管生成及內皮細胞遷移的作用不盡相同，這個觀念也逐漸成為大家的共識。盡管Slit/Robo信號與腫瘤血管之間的很多問題尚未解決，但是隨著研究的深入，Slit/Robo信號通路很有可能成為抗腫瘤血管治療的新靶點。

4 Slit/Robo信號對腫瘤細胞生長及遷移的作用

腫瘤細胞生長及遷移是原發性腫瘤發展為繼發性腫瘤的一個必要條件，也是腫瘤患者死亡的主要原因。Slit/Robo信號對腫瘤細胞生長及遷移的作用報道不一，在抑制腫瘤細胞生長及遷移方面，有研究報道在乳腺癌細胞MDA-MB-231中，添加重組的Slit2能夠縮小腫瘤體積，應用Robo1-Fc阻斷Slit2可使腫瘤生長，并使細胞形成更具侵犯性的形態[24]。Kong等[25]發現表達Slit的肺癌細胞的成瘤能力及侵襲能力均降低。他們認為，抑癌基因Slit通過結合Robo受體，進而使Robo受體胞內區域結合肌球蛋白9（Myo9b）的RhoGAP酶，并抑制RhoGAP酶活性，從而抑制GTP-RhoA向GDP-RhoA轉化，導致GTP-RhoA增加，進而抑制細胞的遷移及侵襲。Slit-Robo Rho GTP酶激活蛋白1（Slit-Robo GTPase-activating protein 1，srGAP1）是Slit-Robo途徑下游的關鍵GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP），已有研究顯示，通過減少活化的Cdc42能夠抑制神經膠質瘤細胞的侵襲[26]。Feng等[27]發現SrGAP1在結腸癌細胞中的表達較癌旁組織下降47.5%，且與淋巴管浸潤、腫瘤分化差、TNM分期高、生存期短有關。與Slit2結合后，Robo1胞質內結構域發生改變，并促使srGAP1募集到Robo1的胞內結構域，可通過減少活化的Cdc42，抑制結腸癌腫瘤細胞的遷移。在食管癌中，Slit2對Cdc42和細胞遷移的負調控作用也有報道[28]。Slit/Robo信號通路還可抑制口腔鱗狀細胞癌的遷移[29]。

在促進腫瘤細胞生長及遷移方面，Zhao等[30]發現通過上調MMP-2、MMP-9及下調E-鈣黏連蛋白，Slit2/Robo1信號通路可促進舌癌細胞的黏附、侵襲及轉移。通過在小腸癌小鼠模型中研究發現，Slit2、Robo1在小腸癌中呈過表達，激活Slit2/Robo1信號通路可誘導小腸黏膜發生惡變，并通過活化Src信號下調E-鈣黏連蛋白，進而激活Wnt/βcatenin 途徑，促進腫瘤的發生、發展[31]。Li等[32]發現Robo1、Robo4表達于膀胱癌細胞中，阻斷Robo4對種植瘤的存活及生長無影響，而阻斷Robo1后，種植瘤的存活量及體積明顯縮小。Schmid等[10]研究發現，CXCR4、Robo1、Slit2均可以在乳腺癌細胞系及乳腺癌組織中表達，CXCL12誘導的乳腺癌細胞遷移作用可以被Slit2抑制，但Slit2對表達Robo1的乳腺癌細胞具有誘導細胞遷移的作用，并且Slit/Robo信號通路可以上調MMP-9基因的表達，增強腫瘤細胞的侵襲性。

Slit/Robo信號通路在腫瘤細胞生長及遷移中的作用目前尚無定論，甚至矛盾，例如在結腸癌中，Slit2結合Robo1受體可以誘導結腸癌細胞的生長及轉移[33]。而Chen等[34]認為Slit2可通過抑制AKT信號通路和上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）發揮抑制結直腸癌轉移的作用。Huang等[35]認為Slit2/Robo1信號對結腸癌細胞的抑制遷移作用由泛素特異性蛋白酶33（ubiquitin specific protease 33，USP33）介導，并將USP33作為結腸癌的一個獨立的預后指標。

各方面矛盾的研究結果說明了Slit/Robo信號通路對腫瘤生長及遷移作用的復雜性，這與Slit/Robo信號通路的多個受體、配體參與及其下游的多種機制調控有關，甚至在一些腫瘤中，腫瘤細胞周圍的間葉組織也可參與到該信號通路中，對腫瘤的侵襲發揮作用[36]。因此，對Slit/Robo信號通路與腫瘤的關系進行研究時，不能孤立地僅看某一方面的作用，從多方面思考可能會加深對兩者深層次關系的認識，從而為今后的研究提供更加廣闊的視野。

5 小結與展望

綜上所述，盡管Slit/Robo信號通路對腫瘤發生、發展的作用及機制尚未完全闡明，甚至現有的報道存在矛盾，但仍可看出其與腫瘤密切相關。綜合目前已有的研究或報道，筆者大膽地推測，Slit/Robo信號通路對腫瘤的作用與Slit、Robo結合的受配體及腫瘤周圍的微環境有關。不同的Slit、Robo如何結合，不同亞型的Slit/Robo信號通路對腫瘤的作用如何，對腫瘤的作用受哪些因素的影響，Slit/Robo信號通路下游機制是什么，這些復雜的問題均有待于進一步深入研究，從而為腫瘤的治療提供新的理論依據。

參考文獻

[1]London NR,Li DY.Robo4-dependent Slit signaling stabilizes the vasculature during pathologic angiogenesis and cytokine storm[J].Curr Opin Hematol,2011,18(3):186-190.

[2]Rama N,Dubrac A,Mathivet T,et al.Slit2 signaling through Robo1 and Robo2 is required for retinal neovascularization[J].Nat Med,2015,21(5):483-491.

[3]Zhao Y,Su Y,Ye L.Slit-Robo:a potential way to treat periodontitis[J].Med Hypotheses,2012,79(2):186-188.

[4]Morin-Poulard I,Sharma A,Louradour I,et al.Vascular control of the drosophila haematopoietic microenvironment by Slit/Robo signalling[J].Nat Commun,2016,7:11634.

[5]Fish JE,Wythe JD,Xiao T,et al.A Slit/miR-218/Robo regulatory loop is required during heart tube formation in zebrafish[J].Development,2011,138(7):1409-1419.

[6]Bauer K,Dowejko A,Bosserhoff AK,et al.Slit-2 facilitates interaction of p-cadherin with robo-3 and inhibits cell migration in an oral squamous cell carcinoma cell line[J].Carcinogenesis,2011,32(6):935-943.

[7]Ballard MS,Hinck L.A roundabout way to cancer[J].Adv Cancer Res,2012,114:187-235.

[8]Wang B,Xiao Y,Ding BB,et al.Induction of tumor angiogenesis by Slit-Robo signaling and inhibition of cancer growth by blocking Robo activity[J].Cancer Cell,2003,4(1):19-29.

[9]Gr?ne J,Doebler O,Loddenkemper C,et al.Robo1/Robo4:differential expression of angiogenic markers in colorectal cancer[J].Oncol Rep,2006,15(6):1437-1443.

[10]Schmid BC,Rezniczek GA,Fabjani G,et al.The neuronal guidance cue Slit2 induces targeted migration and may play a role in brain metastasis of breast cancer cells[J].Breast Cancer Res Treat,2007,106(3):333-342.

[11]Singh RK,Indra D,Mitra S,et al.Deletions in chromosome 4 differentially associated with the development of cervical cancer:evidence of Slit2 as a candidate tumor suppressor gene[J].Hum Genet,2007,122(1):71-78.

[12]Dallol A,Morton D,Maher ER,et al.Slit2 axon guidance molecule is frequently inactivated in colorectal cancer and suppresses growth of colorectal carcinoma cells[J].Cancer Res,2003,63(5):1054-1058.

[13]Dallol A,Da Silva NF,Viacava P,et al.Slit2,a human homologue of the Drosophila Slit2 gene,has tumor suppressor activity and is frequently inactivated in lung and breast cancers[J].Cancer Res,2002,62(20):5874-5880.

[14]Narayan G,Goparaju C,Arias-Pulido H,et al.Promoter hypermethylation-mediated inactivation of multiple Slit-Robo pathway genes in cervical cancer progression[J].Mol Cancer,2006,5(1):16.

[15]Marlow R,Strickland P,Lee JS,et al.Slits suppress tumor growth in vivo by silencing Sdf1/Cxcr4 within breast epithelium[J].Cancer Res,2008,68(19):7819-7827.

[16]Avci ME,Konu O,Yagci T.Quantification of Slit-Robo transcripts in hepatocellular carcinoma reveals two groups of genes with coordinate expression[J].BMC Cancer,2008,8(1):392.

[17]Wang LJ,Zhao Y,Han B,et al.Targeting Slit-roundabout signaling inhibits tumor angiogenesis in chemical-induced squamous cell carcinogenesis[J].Cancer Sci,2008,99(3):510-517.

[18]Yang XM,Han HX,Sui F,et al.Slit-Robo signaling mediates lymphangiogenesis and promotes tumor lymphatic metastasis[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,396(2):571-577.

[19]Seth P,Lin Y,Hanai J,et al.Magic roundabout,a tumor endothelial marker:expression and signaling[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,332(2):533-541.

[20]Stella MC,Trusolino L,Comoglio PM.The Slit/Robo system suppresses hepatocyte growth factor-dependent invasion and morphogenesis[J].Mol Biol Cell,2009,20(2):642-657.

[21]Enomoto S,Mitsui K,Kawamura T,et al.Suppression of Slit2/robo1 mediated huvec migration by Robo4[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,469(4):797-802.

[22]Sheldon H,Andre M,Legg JA,et al.Active involvement of Robo1 and Robo4 in filopodia formation and endothelial cell motility mediated via WASP and other actin nucleation-promoting factors[J].FASEB J,2009,23(2):513-522.

[23]Zhang B,Dietrich UM,Geng JG,et al.Repulsive axon guidance molecule Slit3 is a novel angiogenic factor[J].Blood,2009,114(19):4300-4309.

[24]Brantley-Sieders DM,Dunaway CM,Rao M,et al.Angiocrine factors modulate tumor proliferation and motility through EphA2 repression of Slit2 tumor suppressor function in endothelium[J].Cancer Res,2011,71(3):976-987.

[25]Kong R,Yi F,Wen P,et al.Myo9b is a key player in Slit2/Robo-mediated lung tumor suppression[J].J Clin Invest,2015,125(12):4407-4420.

[26]Yiin JJ,Hu B,Jarzynka MJ,et al.Slit2 inhibits glioma cell invasion in the brain by suppression of Cdc42 activity[J].Neuro Oncol,2009,11(6):779-789.

[27]Feng Y,Feng L,Yu D,et al.SrGAP1 mediates the migration inhibition effect of Slit2-Robo1 in colorectal cancer[J].J Exp Clin Cancer Res,2016,35(1):191.

[28]Tseng RC,Chang JM,Chen JH,et al.Deregulation of Slit2-mediated Cdc42 activity is associated with esophageal cancer metastasis and poor prognosis[J].J Thorac Oncol,2015,10(1):189-198.

[29]Bauer K,Dowejko A,Bosserhoff AK,et al.Slit-2 facilitates interaction of P-cadherin with Robo-3 and inhibits cell migration in an oral squamous cell carcinoma cell line[J].Carcinogenesis,2011,32(6):935-943.

[30]Zhao Y,Zhou FL,Li WP,et al.Slit2-Robo1 signaling promotes the adhesion,invasion and migration of tongue carcinoma cells via upregulating matrix metalloproteinases 2 and 9,and downregulating E-cadherin[J].Mol Med Rep,2016,14(3):1901-1906.

[31]Zhang QQ,Zhou DL,Lei Y,et al.Slit2/Robo1 signaling promotes intestinal tumorigenesis through src-mediated activation of the Wnt/β-catenin pathway[J].Oncotarget,2015,6(5):3123-3135.

[32]Li Y,Cheng H,Xu W,et al.Expression of Robo protein in bladder cancer tissues and its effect on the growth of cancer cells by blocking Robo protein[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(9):9932-9940.

[33]Zhou WJ,Geng ZH,Chi S,et al.Slit-Robo signaling induces malignant transformation through Hakai-mediated E-cadherin degradation during colorectal epithelial cell carcinogenesis[J].Cell Res,2011,21(4):609-626.

[34]Chen WF,Gao WD,Li QL,et al.Slit2 inhibits cell migration in colorectal cancer through the AKT-GSK3β signaling pathway[J].Int J Colorectal Dis,2013,28(7):933-940.

[35]Huang Z,Wen P,Kong R,et al.USP33 mediates Slit-Robo signaling in inhibiting colorectalcancercell migration[J].Int J Cancer,2015,136(8):1792-1802.

[36]Secq V,Leca J,Bressy C,et al.Stromal Slit2 impacts on pancreatic cancer-associated neural remodeling[J].Cell Death Dis,2015,6:e1592.