活性氧抑制劑NAC對人乳腺癌細胞化療的增敏作用觀察及機制初探

王 靜

(湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院腫瘤科，襄陽 441000)

乳腺癌是世界女性惡性腫瘤中最常見的疾病之一，據WHO國際癌癥研究中心調查顯示，2010年世界女性乳腺癌新發(fā)病例約占全部女性惡性腫瘤的23%，且每年死亡人數達50萬，占所有女性死亡人數的1.8%[1]。近年來，隨著女性生活壓力的增加、生活節(jié)奏不斷加快，乳腺癌的發(fā)病率及死亡率逐年升高，嚴重威脅女性的生命健康。當前，化療法已成為乳腺癌患者的主要治療手段之一，但是患者對化療藥物尤其是蒽環(huán)類藥物的耐藥性已嚴重影響療效，如何增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性是當前亟待解決的問題[2]。研究發(fā)現[3]，機體處于應激狀態(tài)時可釋放大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，可通過激活癌基因方式誘發(fā)正常細胞癌變。已有研究顯示[4]，ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)可對多柔比星(Doxorubicin，Dox)治療人胰腺癌起到增敏作用，但關于NAC對Dox治療人乳腺癌的增敏作用鮮有研究，因此，本研究觀察NAC在Dox對MCF-7細胞株化療過程中的增敏作用，并初步探討其調控機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 人乳腺癌細胞株MCF-7，購于上海生科院細胞庫。

1.1.2藥物 活性氧抑制劑NAC，Sigma公司，CAS號：616-91-1；鹽酸多柔比星注射液，輝瑞制藥(無錫)有限公司，批準文號：國藥準字H20013334；規(guī)格：10 mg。

1.1.3主要試劑 異硫氰酸熒光素標記的連接素(Annexin-Fluorescein isothiocyanate，Annexin-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒、二甲基噻唑試劑盒(Dimethyl-2-thiazolyl，MTT)，廣州碧云天有限公司；Hoechst33342 PI熒光染料，Solarbio公司；無血清細胞凍存基礎培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)基)、胎牛血清，Gibco公司；2′，7′-二氯熒光素雙乙酸鹽(2′，7′-Dichlorodihydrofluorescin diacetate，DCFH-DA)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、Trizol，Sigma公司；ROS檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)兔抗人多克隆抗體(一抗)、Caspase-3、Bcl-2、Bax 辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白(二抗)，Abcam公司。

1.1.4主要儀器 DMi8型倒置熒光顯微鏡、TCS-SP8型激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡公司；Multiskan GO型酶標儀，Thermo公司；Cyto FLEX型流式細胞儀，Beckman Coulter公司。

1.2方法

1.2.1實驗前準備 NAC用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)配置成300 mmol/L母液，-20℃保存，實驗前用PBS配置為10、30、60 mmol/L低、中、高3種濃度。

1.2.2細胞培養(yǎng)及分組 MCF-7人乳腺癌細胞，購于上海生科院細胞庫，以RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，37℃、5%CO2恒定條件下常規(guī)培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況，待細胞生長至對數期時，將細胞分裝于6孔板中，隨機分為5組，每組5個復孔，待細胞貼壁后，Dox組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和對照組分別用0.4 μg/ml Dox、0.4 μg/ml Dox+(10、30、60 mmol/L)NAC、PBS進行處理，常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3細胞凋亡率測定 收集培養(yǎng)至12、24、48 h的MCF-7人乳腺癌細胞，Hoechst33342 PI染料緩沖液重懸，嚴格根據細胞凋亡試劑盒說明書步驟進行操作，采用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.2.4細胞內ROS水平測定 收集培養(yǎng)至48 h的MCF-7人乳腺癌細胞，用無血清培養(yǎng)基調整細胞濃度為2×104/孔，嚴格按照ROS檢測試劑盒說明書步驟操作，采用熒光探針標記法檢測。加入無血清細胞培養(yǎng)液配置的濃度為3 μmol/L的DCFH-DA，37℃恒溫孵育30 min，PBS緩沖液洗滌3次后，加入無血清細胞培養(yǎng)液，應用激光共聚焦顯微鏡掃描攝像(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長520 nm)，熒光強度用Zeiss LSM Image Examiner軟件進行分析。

1.2.5Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達水平測定 收集培養(yǎng)至48 h的MCF-7人乳腺癌細胞，采用Trizol法提取總RNA。按照試劑盒說明書將mRNA逆轉錄cDNA。實時熒光定量PCR儀進行檢測，反應條件為：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，59℃退火20 s，72℃延伸60 s，重復40個循環(huán)，然后72℃延伸5～10 min，以β-actin作為內參。采用凝膠成像系統測定Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量，以2-ΔΔCT為目的基因的相對表達強度。Caspase-3：上游引物：5′-CATAGCTCTACTCTAGGCTATCGCT-3′，下游引物：5′-CATCCGGTCTGGTAGCCATCT-GCAG-3′；Bcl-2：上游引物：5′-ACTACCTAGTCAGAGCGTAGCTATG-3′，下游引物：5′-GCTGCTCGGAGAACTGTCGACCTTG-3′；Bax：上游引物：5′-GCACGGACTATCACTGTGAACAGCC-3′，下游引物：5′-ATCTATCGCTGCAGTTCGACACTATG-3′；β-actin：上游引物：5′-GTGTACGGTGCATGCCTACGTGAGA-3′，下游引物：5′-ACGGACTAGCGCTCTGTCTAGCGCA-3′。

1.2.6Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達水平測定 收集培養(yǎng)至48 h的MCF-7人乳腺癌細胞，根據蛋白提取試劑盒步驟提取總蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白總量。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳法分離，并轉移至硝酸纖維素膜上。用脫脂奶粉搖床封閉1 h，加入一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，加入二抗(1∶5 000)，常溫孵育1 h，暗室中曝光、顯色。應用凝膠成像軟件掃描拍照，使用BandScan灰度值分析軟件分析，以Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白灰度值與內參β-actin灰度值比表示其相對表達量。

1.2.7觀察指標 ①乳腺癌細胞凋亡率對比；②乳腺癌細胞內ROS水平對比；③Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量對比；④Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量對比。

2 結果

2.1乳腺癌細胞凋亡率對比 乳腺癌細胞凋亡率，組間、時間及交互比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。乳腺癌細胞凋亡率組間比較，對照組最低、Dox組其次，低，高劑量組稍高，中劑量組最高，除低劑量組與高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，其他每兩組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)；組內比較，除對照組隨時間變化差異無統計學意義(P>0.05)，其他各組均隨時間延長顯著增加(P<0.05)。結果見圖1、表1。

2.2乳腺癌細胞內ROS水平對比 乳腺癌細胞內ROS熒光強度組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。ROS熒光強度組間比較，對照組最低、中劑量組其次，低、高劑量組稍高，Dox組最高，除低劑量組與高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，其他每兩組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結果見表2，圖2、3。

2.3Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量對比 Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。Bcl-2 mRNA相對表達量組間比較，對照組最高，Dox組其次，低、高劑量組稍低，中劑量組最低，除低劑量組與高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，其他每兩組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)；Caspase-3、Bax mRNA相對表達量組間比較，對照組最低，Dox組其次，低、高劑量組稍高，中劑量組最高，除低劑量組與高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，其他每兩組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結果見表3、圖4。

圖1 凋亡率對比(%)Fig.1 Comparison of rate of apoptosis(%)

Groupsn12 h24 h48 hControl group58.60±1.319.37±1.0210.16±1.10Dox group521.10±3.501)36.75±3.711)5)48.91±5.011)5)6)Low dose group 535.46±4.161)2)48.08±4.901)2)5)66.07±4.231)2)5)6)Middle dose group551.37±5.251)2)3)65.79±6.121)2)3)5)84.04±5.791)2)3)5)6)High dose group537.80±4.601)2)4)50.11±5.211)2)4)5)68.53±4.611)2)4)5)6)FF inter group=21.209,F moments=41.067,F interactive=30.139PP inter group=0.000,P moments=0.000,P interactive=0.000

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the Dox group，2)P<0.05；compared with the low dose group，3)P<0.05；compared with the middle dose group，4)P<0.05；compared with 12 h，5)P<0.05；compared with 24 h，6)P<0.05.

Groupsn48 hControl group551.08±6.41Dox group5105.71±8.441)Low dose group 587.42±7.491)2)Middle dose group565.30±5.371)2)3)High dose group585.36±7.531)2)4)F88.202P0.000

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the Dox group，2)P<0.05；compared with the low dose group，3)P<0.05；compared with the middle dose group，4)P<0.05.

圖2 各組ROS熒光強度(×400)Fig.2 Ros fluorescence intensity of each group(×400)Note: A.Control group;B.Dox group;C.Low dose group;D.Middle dose group;E.High dose group.

圖3 細胞內ROS熒光強度對比Fig.3 Contrast of intracellular ROS fluorescence intensity

GroupsnCaspase-3Bcl-2BaxControl group50.42±0.071.45±0.08e0.37±0.04efDox group50.73±0.081)1.28±0.121)5)0.50±0.051)5)6)Low dose group 50.91±0.101)2)1.06±0.101)2)5)0.69±0.071)2)5)6)Middle dose group51.32±0.161)2)3)0.72±0.081)2)3)5)0.88±0.081)2)3)4)5)High dose group50.95±0.061)2)4)0.96±0.091)2)4)5)0.71±0.061)2)4)5)6)F53.53044.19451.645P0.0000.0000.000

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the Dox group，2)P<0.05；compared with the low dose group，3)P<0.05；compared with the middle dose group，4)P<0.05.

圖4 Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA相對表達量Fig.4 Relative expressions of Caspase-3, Bcl-2 and Bax mRNA

GroupsnCaspase-3Bcl-2BaxControl group50.97±0.091.53±0.105)0.51±0.065)6)Dox group51.19±0.091)1.35±0.121)5)0.62±0.071)5)6)Low dose group 51.32±0.101)2)1.13±0.101)2)5)0.80±0.051)2)5)6)Middle dose group51.59±0.131)2)3)0.86±0.081)2)3)5)1.22±0.101)2)3)5)6)High dose group51.35±0.101)2)4)1.18±0.091)2)4)5)0.83±0.081)2)4)5)6)F24.33132.18366.998P0.0000.0000.000

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the Dox group，2)P<0.05；compared with the low dose group，3)P<0.05；compared with the middle dose group，4)P<0.05.

2.4Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量對比 Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。Bcl-2蛋白相對表達量組間比較，對照組最高,Dox組其次,低、高劑量組稍低,中劑量組最低，除低劑量組與高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，其他每兩組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)；Caspase-3、Bax蛋白相對表達量組間比較，對照組最低，Dox組其次，低、高劑量組稍高，中劑量組最高，除低劑量組與高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，其他每兩組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結果見表3，圖5、6。

圖5 Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白免疫印跡圖Fig.5 Immunoblotting of Caspase-3，Bcl-2 and Bax protein

圖6 Caspase-3、Bcl-2、Bax 蛋白相對表達量對比Fig.6 Relative expressions of Caspase-3, Bcl-2 and Bax protein

3 討論

乳腺癌發(fā)病病因與發(fā)病機制尚未完全闡明，可能與細胞周期調控相關因子、女性雌激素分泌紊亂、家族遺傳等因素有關[5-7]。研究發(fā)現[8]，乳腺癌患者出現化療藥物耐藥性是導致化療失敗的重要原因，產生多藥耐藥的機制主要有p-糖蛋白藥泵或細胞內解毒相關蛋白酶異常高表達、抗腫瘤藥物作用靶點性質改變等。原發(fā)性耐藥、化療后復治產生耐藥是影響化療藥物療效的重要原因，因此提高乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性對提高治療效果十分重要[9]。研究發(fā)現[10]，ROS大量產生后可通過氧化細胞內特異性化學簇，導致DNA突變或者激活炎癥因子釋放途徑，最終可導致癌基因激活或抑制細胞正常凋亡程序的啟動，控制腫瘤細胞內ROS含量可有效促進細胞凋亡、抑制細胞分化等過程。

本研究發(fā)現，細胞凋亡率組間比較，Dox組最低，低、高劑量組其次，中劑量組最高(P<0.05)；ROS熒光強度組間比較，對照組最低，中劑量組其次，低、高劑量組稍高，Dox組最高(P<0.05)；組內比較各組乳腺癌細胞凋亡率均隨時間延長顯著增加(P<0.05)，說明30 mmol/L的NAC與Dox聯用促進人乳腺癌細胞凋亡、調節(jié)細胞內ROS含量效果最佳，提示NAC可增強MCF-7細胞對Dox化療敏感性。本研究中應用NAC與化療藥物Dox聯用調節(jié)細胞內ROS水平與宋瑤等[11]研究結果相符，在其研究中單用化療藥物組ROS陽性表達率為(67.32±3.75)%，聯用組為(45.32±7.23)%，對照組為(25.32±3.20)%，證實NAC確實可調節(jié)細胞內ROS水平。研究發(fā)現，機體中正常細胞可同多個信號途徑修復DNA損傷，抑制遺傳粗變發(fā)生，在具有癌變傾向的細胞中DNA修復功能失衡，DNA突變累積至一定水平時誘發(fā)癌變[12，13]。ROS是指產生于呼吸鏈中的一類單電子高活性基團[14]，可直接或間接啟動過氧化作用，ROS在正常機體中含量穩(wěn)定，具有雙向調節(jié)作用，較低濃度ROS水平具有一定修復細胞損傷的功能，腫瘤細胞內ROS水平較低，利于其存活。本研究中應用Dox化療時腫瘤細胞內ROS顯著升高，應用活性氧抑制劑NAC后，腫瘤細胞內ROS水平降低至一定水平，腫瘤細胞凋亡率較單用Dox升高。由此可知，NAC在一定濃度范圍內具有輔助Dox促進細胞凋亡的作用。

此外，本研究中，Bcl-2 mRNA及蛋白相對表達量組間比較，對照組最高，Dox組其次，低、高劑量組稍低，中劑量組最低(P<0.05)；Caspase-3、Bax mRNA及蛋白相對表達量組間比較，對照組最低、Dox組其次，低、高劑量組稍高，中劑量組最高(P<0.05)，提示NAC可增強MCF-7細胞對Dox化療敏感性的調控機制可能是通過降低Bcl-2 mRNA及蛋白表達，增強Caspase-3、Bax mRNA及蛋白表達而實現。Caspase-3是Caspase蛋白酶家族的重要成員[15]，該蛋白酶在調控細胞凋亡過程中發(fā)揮關鍵酶作用，該蛋白酶一旦被激活，其下游一系列蛋白酶被激活，可通過激活細胞表面死亡受體途徑或線粒體途徑引起細胞結構或功能異常，最終引起細胞死亡。Bcl-2家族廣泛存在于線粒體內，可使線粒體膜電位增強，阻止線粒體內Ca+釋放和核酸內切酶激活，進而發(fā)揮抗凋亡作用[16]。Bax是與Bcl-2相關的一類蛋白，且與Bcl-2高度同源，該蛋白可直接激活Caspase-3，進而激活死亡效應級聯反應過程，同時抑制Bcl-2蛋白活性，發(fā)揮促凋亡作用[17，18]。由此，NAC在一定濃度范圍內與Dox聯用可能通過降低細胞內ROS水平，進而激活Bcl-2/Bax信號轉導通路，發(fā)揮促凋亡作用。

綜上所述，在一定范圍內，NAC與Dox聯用可顯著促進人乳腺癌細胞凋亡、調節(jié)細胞內ROS含量，可顯著增強人乳腺癌細胞對Dox化療敏感性，其中30 mmol/L的NAC效果最佳，推測其增敏調控機制是通過降低Bcl-2 mRNA及蛋白表達，增強Caspase-3、Bax mRNA及蛋白表達，進而發(fā)揮促進細胞凋亡的作用，且與Bcl-2 /Bax信號通路有關，為臨床中應用NAC增強乳腺癌患者對化療藥物的敏感性提供理論基礎。