PLGF對大鼠坐骨神經離斷模型神經遠端恢復的影響

王婷，于灝，胡昕 ，魏侃，王寧

（1.沈陽醫學院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽醫學院附屬中心醫院 手外科研究所，遼寧 沈陽 110024；3.手外1科）

外周神經損傷病程持久，甚至造成殘疾，大大增加了患者的經濟負擔[1]，對患肢功能影響巨大，因此針對神經修復治療方法的探尋十分重要。本實驗在大鼠坐骨神經離斷修復后，于斷端局部添加外源性PLGF，并以人工神經鞘管包饒，創造軸突再生的營養微環境并減少PLGF向周圍組織浸潤[2]，通過觀察不同時間點遠端神經p75NGFR的表達及Bungner帶的形成數量，間接反映雪旺細胞的增殖及遷移情況，從而評定PLGF在不同時間段對Wallerian變性進程的影響程度，以探索神經修復治療的新途徑。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立

SD大鼠18只作為實驗對象，體重200～300 g，由沈陽醫學院實驗動物中心提供。于溫度適宜、食物充足、光照良好的環境中飼養。所有程序均按照動物倫理審查委員會批準的協議進行。

術前配制0.2%氯胺酮和0.2%地西泮混合溶液，按2.5 mL/100 g腹腔注射麻醉。麻醉成功后，取俯臥位于實驗臺上，四肢外展固定，利用眼科剪于雙側大腿及臀部后側去毛備皮術區，碘酒常規消毒后鋪孔巾。取大腿背側縱行切口，銳性切開皮膚后，顯露出股二頭肌及股四頭肌，鈍性分離兩肌肉的肌間隙，小心游離坐骨神經 15～20 mm（以便離斷）（圖1a），以坐骨大孔處即閉孔內肌近端1 cm平面為離斷界面（圖1b）。

按照 PLGF（SRP4743，Sigma，美國）說明書制備工作液，此前實驗證實其最適濃度為4 nM[3]。持眼科剪取得人工神經鞘管（SSN 5/30，天義福，中國）3 mm，將其夾入之前分裝好實驗濃度PLGF的小管內，充分浸濕后備用。因而我們得到4nMⅠ型膠原神經鞘管-PLGF復合物。規定以大鼠左肢為實驗組，右肢為對照組。對照組用8/0可吸收縫合線作神經外膜縫合神經，縫合口外包繞并固定神經鞘管（Ⅰ型膠原），而后逐層縫合皮膚。實驗組用8/0可吸收縫合線縫合神經外膜后，將Ⅰ型膠原神經鞘管-PLGF復合物包繞并固定于神經縫合口，逐層縫合肌肉皮膚。本實驗中實驗組采用神經鞘管浸潤PLGF后包繞縫合口，以期通過鞘管降解來緩釋PLGF。對照組包繞鞘管為空白對照（圖1c，1d）。

1.2 樣本取材

分別于術后 1，4，7，15，30 d 各取出兩只大鼠，以空氣栓塞的方法處死，切取雙側神經縫合口遠端至少2 cm長的坐骨神經，予4%多聚甲醛中浸泡固定，沿神經長軸包埋并切片。

1.3 免疫組化染色

經脫蠟水化后，經0.01 M的PBS清洗后，正常兔血清封閉30 min后傾掉，加入p75 NGFR重組抗體（EP1039Y，Abcam，美國），在 4℃環境下孵育過夜，第2天經0.01 M的PBS清洗，滴加兔IgG（SA1022，博士德，中國），室溫封閉30 min后再以經0.01 M的PBS清洗。加入新鮮DAB工作液濕盒封閉，于鏡下監測到合適顯色后水洗，再入蘇木素復染后水洗，最后入酸乙醇分化后水洗，脫水封片。

1.4 組織學評價

應用ImageProPlus6.0分析上述切片p75NGFR免疫組化陽性程度及Bungner帶數量。以平均光密度值Density(mean)表達免疫組化陽性程度；以3～5個連成一線的細胞核作為Bungner帶來計數。每張切片均于高倍視野下（×200）下隨機取三個視野進行分析計算，數值以均數±標準差（±s）來表達，利用SPSS 19.0軟件做同一時間點下實驗組與對照組的成對單側t檢驗，P＜0.05認為組間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p75NGFR免疫組化表達

p75NGFR免疫組化表達見圖2。p75 NGFR在視野中表達的面積（area）和IOD分別測定值見表1。

分別計算兩組每個時間點p75 NGFR的Density(mean)值。結果及趨勢變化見圖3，可見大鼠坐骨神經離斷后對照組遠端p75 NGFR的表達隨時間推移而增加，4 d后其表達進入平臺期，15 d后表達逐漸下降；而實驗組較對照組p75 NGFR的表達在術后24 h時間點顯著增加，而后其表達趨勢與對照組相似，30 d時表達雖有下降，但仍顯著高于對照組。

圖1 手術操作示意圖

2.2 Bungner帶計數

在術后1 d的時間點中我們觀察到Bungner帶并未廣泛形成，應該尚處在形成過程中。離斷神經遠端雪旺細胞雖未明顯增殖，但實驗組較對照組有多處3～5個細胞核成行排列（圖2a1，a2）。統計實驗組和對照組細胞核排列成行數量情況，可見實驗組顯著高于對照組（圖4）。

3 討論

在神經損傷后神經遠端發生Wallerian變性，這個過程中雪旺細胞激活并表達p75NGFR，經歷去分化、增殖，并遷移形成Bungner帶是關鍵步驟。PLGF可以增加包括雪旺細胞在內的多種細胞的遷移能力[3-6]，而Wallerian變性時雪旺細胞表達PLGF可促進自身的增殖[7]，因此我們在離斷神經縫合口添加外源性PLGF并通過與空白對照組比較，觀察不同時間點神經遠端p75 NGFR的免疫組化陽性的表達程度以及Bungner帶形成數量，反映其對受損神經Wallerian變性進程的影響。

本實驗中在大鼠坐骨神經離斷后，對照組遠端p75 NGFR的表達隨時間推移而增加，4 d后其表達進入平臺期，15 d后表達逐漸下降（圖3），這與其他學者的研究結果相似，有學者認為在神經損傷后神經因子及其受體會有一個快速而短暫的的上調期，在一個月或更長時間以后回歸基線水平[8]，Heng Shao等[9]則證實損傷神經遠端的p75 NGFR強染色可持續14 d，而在28 d以后p75 NGFR的表達在細胞成分中明顯下降。然而在本研究中通過觀察實驗組，我們發現p75 NGFR的表達在24 h時間點較對照組顯著增加，而后其表達趨勢與對照組相似，30 d時表達雖有下降，但仍顯著高于對照組（圖3），這說明在Wallerian變性中添加外源性PLGF具有促進p75 NGFR表達的作用，而該促進作用有可能由于外源性PLGF促進雪旺細胞增殖及促進雪旺細胞高表達p75 NGFR引起。

圖2 大鼠坐骨神經p75NGFR免疫組化染色（200×鏡下觀）

圖3 p75 NGFR不同時間點表達情況(*P＜0.05）

有學者報道神經損傷3 d后去分化的雪旺細胞大量增殖并在基膜管內形成Bungner帶[10]，從而為軸突再生提供引導路徑。因此本實驗中我們欲計數各時間點Bungner帶并進行組間對比，但在神經損傷4 d以后的各時間點雪旺細胞高度增殖無法確切計數，而在神經損傷后1 d的時間點中我們觀察到離斷神經遠端雪旺細胞雖未明顯增殖，但有多處3～5個細胞核成行排列（圖2a1）且實驗組細胞核排列成行的數量顯著高于對照組。但此時Bungner帶并未廣泛形成，應該尚處在形成過程中。本實驗結果顯示外源性PLGF可以促進雪旺細胞成行排列，考慮到Bungner帶的形成不僅單純是雪旺細胞增殖的結果，通過細胞遷移才能成行排列從而形成Bungner帶。因此我們推測外源性PLGF具有縮短Bungner帶形成時間且促進Bungner帶形成數量的效應。而該效應主要通過促進雪旺細胞遷移來完成。

表1 大鼠坐骨神經p75 NGFR免疫組化結果（±s）

表1 大鼠坐骨神經p75 NGFR免疫組化結果（±s）

注：實驗組與對照組同一時間點p75 NGFR平均光密度值比較 *P＜0.05

時間（d） 面積(um2） IOD IOD/面積Density(mean)實驗組 1 1115,048±109,573 9,466± 1,948 0.0086±0.0025*1,040,745±150,877 16,413± 6,486 0.0165±0.0086 15 1,108,992± 21,734 51,252±18,197 0.0461±0.0160 30 1,185,940± 58,788 24,428± 6,586 0.0205±0.0048*對照組 1 1,123,068±160,163 3,441± 3,207 0.0029±0.0025 4 957,977±119,385 30,867±19,142 0.0310±0.0155 7 929,473±103,460 10,801± 871 0.0116±0.0004 15 1,221,232± 3,521 30,219±20,459 0.0247±0.0167 30 1,222,087± 2,301 7,745± 5,403 0.0063±0.0044 4 764,772±172,577 17,293± 8,140 0.0217±0.0070 7

圖4 1 d時間點下實驗組與對照組bungner帶計數比較（*P＜0.05）

本研究采用外源性PLGF應用于大鼠離斷坐骨神經的縫合口，其可促進神經遠端p75 NGFR高表達，可促進神經再生雪旺細胞成行排列，間接反映出外源性PLGF可促進雪旺細胞增殖及遷移，縮短Bungner帶形成時間，增加Bungner帶形成數量，結果證實外源性PLGF對于神經損傷修復具有積極作用，為進一步促進神經再生及修復神經缺損提供一個新的思路。