氧化牛油對天然牛肉調味基料的賦香效果

樊曉盼 劉靜靜 梁麗雅 吳晨燕 馬儷珍2,

(1. 天津農學院工程技術學院，天津 300384；2. 天津市農副產品深加工技術工程中心，天津 300384；3. 天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300384)

肉香味由基本性香味和特征性香味組成，形成肉香味的前體物質通常分為兩大類：水溶性成分和脂質，形成芳香風味化合物的主要反應包括氨基酸和還原糖之間的美拉德反應、脂質的熱降解反應以及脂質降解產物與美拉德反應之間的相互作用[1]。動物脂肪是肉類特征香味物質形成的重要前體物質，脂肪的加入可使牛肉味、豬肉味、雞肉味等肉香味更容易區別。當燒烤不含脂肪的牛肉時，能判別出是牛肉的比率為45.2%；而假如是燒烤含有10%脂肪的牛肉時，則能夠準確判斷出是否牛肉的比率會增加到90.2%[2]。Hornstein等[3-4]和Pearson等[5]研究發現豬肉、牛肉和羊肉的水溶性提取物經加熱處理后具有類似的香味，而脂肪經加熱處理后則會明顯產生特征性肉香味。

脂肪氧化通常包括脂肪在空氣中的加熱氧化和添加脂肪酶進行的催化氧化。脂肪氧化產物加入到美拉德反應體系中會使制備的肉味調味基料特征性香氣更加突出；脂肪水解產物產生的不飽和脂肪酸通過氧化降解反應也可以產生香味物質或作為美拉德反應的香味前體物質[6-7]。目前，關于脂肪酶氧化結合美拉德熱反應制備肉類調味基料的研究還鮮有報道，而關于脂肪熱氧化參與美拉德反應制備肉味調味基料的技術已有一定的發展[8]。孫寶國[9]在中國第三代肉味香精的生產技術中融合了脂肪調控氧化環節，即將一定氧化程度的脂肪添加到美拉德反應體系中，在遵循“味料同源”的同時，還增強了肉的特征風味，大大降低了脂肪用量。中國許多學者也對脂肪氧化對美拉德熱反應產物風味的影響進行了大量研究。張玲等[10]研究了氧化及未氧化雞脂對“肉酶解液—葡萄糖—半胱氨酸”反應體系風味的影響，結果表明添加氧化脂肪對美拉德反應產物風味的調控作用比添加未氧化脂肪大，從而使熱反應體系呈協調的肉香味，且特征肉香味更加突出。吳肖等[11]在牛肉酶解液中添加不同氧化程度的牛油進行美拉德反應，結果表明不同氧化程度的牛油能夠影響體系中含硫氨基酸和鮮味氨基酸的反應活性，進而影響美拉德反應產物的香氣和味感。

為進一步增強傳統天然牛肉調味基料(Beef Flavor，BF)的特征香氣，本試驗擬以冷凍牛骨肉末為原料，經熱—壓浸提、酶解后，在美拉德反應體系中添加經熱氧化或酶氧化處理過的牛油制成氧化型牛肉調味基料(Oxidized Beef Flavor，OBF)，采用電子鼻、電子舌結合SPME-GC-MS對其揮發性氣味和滋味進行分析，研究熱氧化和酶氧化2種氧化牛油對OBF風味的貢獻效果，為實際生產特征香氣濃郁的肉味調味基料提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛骨肉末：冷凍牛肉胴體電鋸分割時留下的肉末(骨肉質量比為3∶7)，天津掛月食品有限公司；

風味蛋白酶(500 LAPU/g)、復合蛋白酶(1.5 AU/g)：丹麥諾維信公司；

蛋氨酸、脯氨酸：食品級，冀州市華恒生物科技有限公司；

VB1：江西天新藥業有限公司；

葡萄糖、木糖：山東西王糖業有限公司；

脂肪酶：30 U/mg，江蘇一鳴生物有限公司；

新鮮牛油：天津伊興清真食品有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：SX-500型，日本TOMY有限公司；

水浴恒溫振蕩器：WE-2型，天津市歐諾儀器儀表有限公司；

電子舌：Astree型，法國Alpha M.O.S公司；

電子鼻：PEN3型，德國AIRSENSE公司；

電動攪拌器：D8401W 型，天津市華興科學儀器廠；

玻璃轉子流量計：LZB3型，浙江余姚流量儀表廠；

電磁式空氣壓縮機：ACO208型，浙江森森實業有限公司；

數顯恒溫油浴鍋：yy-1型，江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 熱氧化牛油的制備 在裝有通氣管、電動攪拌器、水銀溫度計和回流冷凝管的500 mL四口燒瓶中加入50 g新鮮牛油，通過調節空氣壓縮機和玻璃轉子流量計按照0.51 L/min 的流速通入空氣進行熱氧化牛油的制備，控制氧化溫度為110 ℃，分別氧化1，2，3，4 h得到不同熱氧化程度的牛油O1、O2、O3和O4。

1.2.2 酶氧化牛油的制備 稱取適量新鮮牛油于錐形瓶中，按照1∶1(質量比)的比例添加磷酸鹽緩沖溶液(pH為6.5)，放置于磁力攪拌器上，轉速為150 r/min，溫度45 ℃，當混合物達到45 ℃時，按照酶/底物(E/S)比率為0.5%(0.5 g脂肪酶/100 g牛油)添加脂肪酶。分別酶解1，2，3，4 h后，將樣品置于沸水浴滅酶10 min，使酶失活，制備出不同酶氧化程度的牛油L1、L2、L3和L4。

1.2.3 OBF的制備 將冷凍牛骨肉末解凍至常溫后，按照牛骨肉末∶水=1∶4(質量比)分別稱取肉末和蒸餾水，充分攪拌均勻后，放置在高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓力0.1 MPa、溫度120 ℃、時間4 h條件下浸提牛骨肉末中的蛋白質，制成牛骨肉蛋白浸提液，添加0.06%風味蛋白酶，0.03%復合蛋白酶，在50 ℃，自然pH條件下酶解4.5 h，沸水浴滅酶20 min后立即冷卻，然后添加1.2.1和1.2.2制成的不同氧化程度的4%氧化牛油、2%木糖、2%葡萄糖、0.4%蛋氨酸、0.4%脯氨酸、1.2% VB1，振蕩均勻后放置于油浴鍋中，在110 ℃條件下進行美拉德反應1.5 h制成OBF，冷卻過濾后分別用電子鼻、電子舌結合GC-MS對其氣味和滋味進行測定，并進行感官評價。添加未氧化牛油制成的OBF記為BFC，添加不同氧化時間的熱氧化牛油制成的OBF記為BFO1～BFO4，添加不同氧化時間的酶氧化牛油制成的OBF記為BFL1～BFL4。

1.2.4 指標測定方法

(1) 牛油酸價的測定：按GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》執行。

(2) 牛油羰基價的測定：按GB 5009.230—2016《食品安全國家標準 食品中羰基價的測定》執行。

(3) 牛油茴香胺值的測定：按GB/T 24304—2009《動植物油脂 茴香胺值的測定》執行。

(4) OBF的氣味分析：取10 mL待測樣品，密封后常溫放置10 min后依次進行測定分析，每個樣品重復3次。

電子鼻工作參數設置為：采樣時間1 s/組，傳感器自動清洗時間180 s，歸零時間10 s，樣品平衡時間10 s，進樣流量5 mL/s，測定分析時間60 s。

(5) OBF的滋味分析：將待測樣品緩慢倒入電子舌專用燒杯(25 mL)中，待測。電子舌傳感器系統包括SRS、SWS、BRS、STS、UMS、SPS、GPS 7根傳感器，其中前5根傳感器(SRS、SWS、BRS、STS、UMS)分別為對酸、甜、苦、咸和鮮味敏感的傳感器，其響應值能夠用來反映不同樣品5種滋味的相對強度。以Ag/AgCl為參比電極，傳感器經活化、校正后開始測樣，每個樣品重復測定6次。

(6) OBF中揮發性化合物的測定：取1 mL樣品置于20 mL 頂空瓶內，采用SPME提取揮發性化合物，再通過GC-MS對化合物進行分離并分析。

固相微萃取條件：采用65 μm PDMS/DVB萃取頭，將樣品置于60 ℃條件下平衡20 min后，插入萃取頭萃取30 min，萃取結束后，拔出萃取頭，置于200 ℃進樣口解析2 min。

色譜條件：選用DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱，柱溫箱初始溫度為40 ℃，進樣口溫度為200 ℃，不分流進樣模式，載氣流速為1 mL/min，柱溫箱升溫程序為40 ℃ 保持3 min，以5 ℃/min升至120 ℃后，再以10 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min。

質譜條件：離子源溫度為200 ℃，傳輸線溫度為250 ℃，采用全掃描(Scan)模式采集信號，掃描范圍為35～500m/z。

1.3 數據統計分析

用Microsoft Excel 2003對試驗數據進行預處理，Statistix 8.1進行數據分析，顯著性差異(P<0.05)通過Turkey test程序進行。氣味和滋味分析用電子鼻和電子舌自帶軟件Alpha soft進行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)。

2 結果與分析

2.1 9組牛油的氧化程度

9組牛油的氧化程度如表1所示。酸價是脂肪中游離脂肪酸含量的標志，從表1可看出，與未氧化(新鮮)牛油(C組)相比，經氧化處理后的牛油酸價均明顯增加，尤其是經脂肪酶處理過的，加酶氧化不同時間的牛油(L1～L4)酸價分別為55.8，82.5，84.9，88.0 mg NaOH/g，這是因為動物油脂多為飽和脂肪酸，常溫貯藏條件下很難被氧化，且牛油的主要成分是甘油三酯，而脂肪酶能夠逐步將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。試驗結果說明采用脂肪酶對牛油進行酶解，可大大提高其游離脂肪酸含量，而脂肪酸會進一步氧化或與其他物質反應生成過氧化物進而分解為香氣閾值很低的酮、醛、酸等揮發性化合物，產生令人愉快的肉香味[12]。羰基價通常是指油脂氧化酸敗后產生的含有醛基和酮基的脂肪酸或甘油酯及其聚合物的總量，是油脂熱劣變的靈敏指標，用來反映油脂氧化產物——酮醛等有害物質的含量和油脂酸敗劣變的程度[13-14]。從表1可看出，9組牛油的羰基價值最低為C組(3.31 meq/kg)，最高為熱氧化4 h的牛油O4組(5.92 meq/kg)，遠遠低于酸敗油脂和加熱劣化油的羰基價(50 meq/kg)，說明本試驗處理過的牛油并未達到酸敗狀態，不會導致不良風味的產生。此外，熱氧化處理的牛油羰基價值整體高于酶氧化牛油，說明加熱更容易導致牛油氧化生成過氧化物，從而進一步分解為含羰基的化合物。茴香胺值是指油脂在氧化劣變過程中產生的醛類化合物的含量，與羰基價一致，都是用來表征油脂劣變程度的指標，從表1還可知，經氧化處理后的牛油茴香胺值最高為L4組(1.33)，其次為O4組(1.17)，且二者差異不顯著(P>0.05)，說明本試驗將油脂氧化時間控制在1～4 h不會造成油脂氧化過度，產生酸敗哈喇味。

表1 9組牛油的氧化程度?

? 不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

2.2 電子鼻檢測OBF風味

采用電子鼻對OBF揮發性氣味的檢測結果如圖1所示。第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為91.42%和4.95%，總貢獻率達到96.37%(>90%)，表明這2個主成分能夠用來反映添加不同氧化牛油制成的OBF揮發性氣味的實際情況。整體來看，添加氧化牛油制成的OBF與BFC均無重疊，表明脂肪氧化能夠顯著影響OBF的揮發性氣味，這與劉金凱等[15]關于氧化羊骨油對羊肉調味基料的風味影響研究結果一致。此外，4組BFO與4組BFL之間也未重疊，表明熱氧化和酶氧化的脂肪對傳統牛肉調味基料揮發性氣味的貢獻效果不同。BFC與BFO1～BFO4的區分指數分別為0.999，0.997，0.996，0.997，說明添加熱氧化牛油制成的OBF風味均與BFC風味差異極顯著。且從圖1可看出，BFO1、BFO2和BFO3重疊部分較多，說明熱氧化1～3 h對OBF氣味影響不大，而氧化4 h時表現出明顯的差異。BFC與BFL1～BFL4的區分指數分別為0.911，0.984，0.997，0.998，說明隨著氧化時間的延長，酶氧化牛油對OBF的風味影響越來越大。而BFL1和BFL2的特征區域有明顯重疊，表明酶解1～2 h的牛油對OBF氣味的貢獻效果相似，酶解3 h的OBF特征區域明顯區別開，而酶解4 h與BFC距離遠，表明酶氧化相比較熱氧化來說，對OBF的揮發性氣體風味影響較大，特別是酶氧化4 h之后這一影響更為明顯。

圖1 電子鼻對不同OBF樣品的主成分分析

2.3 電子舌檢測OBF風味

從圖2(a)可看出，BFC與其他8組之間距離很遠，說明BFC滋味與其他8組差異很大，以致于8組之間的差異情況不易分析，因此圖2(b)僅對8組添加了氧化牛油的OBF滋味進行判別因子分析。電子舌檢測到的8組OBF樣品的特征區域均無重疊，說明8組樣品之間差異顯著，表明不同氧化時間和不同氧化方式的牛油對OBF滋味的貢獻能力不同。在判別因子分析圖中，通常用樣品兩兩間的相對距離分析樣品間滋味差異，樣品間的相對距離越近，則樣品滋味越接近。BFO1與BFO2、BFO3、BFO4之間的相對距離分別為25.25，28.53，28.83；BFO2與BFO3、BFO4之間的相對距離分別為12.26，14.82；BFO3和BFO4之間的相對距離17.5，表明BFO1與其他3組的滋味差別最大，BFO3與BFO4滋味差別較大，其次是BFO2和BFO4，而BFO2和BFO3的滋味最接近。BFL1與BFL2、BFL3、BFL4之間的相對距離分別為11.61，26.35，31.95；BFL2與BFL3、BFL4之間的相對距離分別為22.14，27.1；BFL3和BFL4之間的相對距離為36.28。說明牛油酶氧化時間對OBF的整體滋味影響較大，可能與酶氧化反應劇烈導致牛油組分變化較大有關(表1)[16]。

2.4 GC-MS分析OBF的揮發性化合物

采用SPME-GC-MS分析9組OBF樣品主要揮發性化合物的組成和含量如表2所示，結果顯示BFC中揮發性風味物質種類有9種，BFO1～BFO4中的揮發性風味物質種類分別為14，14，12，12種，BFL1～BFL4中的揮發性風味物質種類分別為6，7，7，7種。與本實驗室前期制備的天然香辛料型牛肉調味基料[17]和微生物發酵型牛肉調味基料[18]相比，本研究采用氧化牛油進行賦香，能夠增強牛肉調味基料的牛肉特征香氣，這是因為添加氧化牛油后，可以平衡體系中的含硫化合物含量，突出令人愉悅的特征肉香味[19]。

在揮發性化合物中，醛類物質一般閾值較低，對風味的直接貢獻作用較大，且具有脂肪香，是肉香味特征香氣的主要構成部分。由表2可知，BFC中醛類物質總相對含量為4.05%；BFO1～BFO4的醛類物質總相對含量分別為5.81%，5.57%，2.92%，3.96%，說明一定程度(氧化1～2 h)的熱氧化牛油對OBF脂肪香氣有貢獻作用，氧化時間越長，反而會降低體系中的醛類物質。BFL1～BFL4的醛類物質總相對含量分別為2.35%，4.16%，2.60%，2.23%，同樣表明并非氧化時間越長越好，當酶氧化時間2 h時，醛類物質相對含量顯著增加，繼續氧化則會導致OBF中醛類物質降低，對體系的香氣貢獻減小。在上述醛類物質中，辛醛和壬醛是對牛肉香氣有重要貢獻作用的成分，從表2可以看出，熱氧化1，2 h時OBF中有辛醛檢出，分別為0.24%和0.61%，酶氧化則不會促進體系中辛醛的形成。2種氧化方式對壬醛含量有影響，同樣是當熱氧化時間為1，2 h時，OBF中可檢出壬醛，相對含量分別為1.12%和1.41%，顯著高于BFC中的壬醛含量(0.43%)。酶氧化2 h對壬醛的形成影響作用最大，占到0.62%，牛油酶氧化至3 h時體系中的壬醛含量則會降低，為0.31%。結果表明熱氧化和酶氧化時間為2 h時，對OBF體系的牛肉香氣貢獻最大，與酶氧化方式相比，經熱氧化處理后的牛油制成的OBF中能夠形成一些新的香氣物質，比如2-乙基-1-己醇、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇、1-辛醇等風味物質。

圖2 電子舌對不同OBF樣品的判別因子分析

表2 OBF主要揮發性化合物的組成及含量

? “-”表示未檢出。

從表2還可看出，9組OBF樣品中的主要揮發性化合物均為4-甲基-5-羥乙基噻唑，相對含量為90.62%～96.05%，而4-甲基-5-羥乙基噻唑是硫胺素亞甲基橋裂解形成的一種食品、肉品和調味品的重要增香物質[20]，說明脂肪氧化與否對其含量無明顯影響(P>0.05)。此外，由于4-甲基-5-羥乙基噻唑的香氣閾值較高，在水中的香氣閾值為10 800 μg/kg，而醛類物質如辛醛、壬醛在水中的香氣閾值分別為 0.7，1.0 μg/kg，因此4-甲基-5-羥乙基噻唑對OBF體系的風味貢獻較小。

3 結論

在牛肉調味基料制備過程中，添加4%不同氧化程度的牛油有一定的賦香作用。電子鼻、電子舌結合SPME-GC-MS檢測結果表明，熱氧化和酶氧化的牛油對OBF風味的貢獻效果不同，經加熱氧化處理的牛油對OBF的特征香氣具有重要貢獻作用，且牛油氧化時間越長，OBF風味差異越明顯；當氧化時間為2 h時，氧化牛油對OBF體系的牛肉特征香氣貢獻最大。本試驗未對氧化處理后的牛油風味物質進行分析，牛油對體系的香氣貢獻機制尚不清楚，下一步應對牛油進行進一步分析研究其賦香機制。