超微粉碎對山銀花微粒結構、有效成分及其抗氧化能力的影響

吳 振 詹 永 李 紅 楊 勇 譚紅軍 黃小平 王海燕

(1. 重慶市中藥研究院，重慶 400065；2. 重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401123；3. 重慶市畜牧科學院，重慶 402460)

山銀花富含粗多糖、有機酸類、黃酮類、三萜皂苷類、環烯醚萜類、揮發油類及微量元素等活性成分，特別是綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙、咖啡酸等活性成分含量較高，其綠原酸和總皂苷含量一般高于金銀花[1-3]。研究表明，山銀花及其提取物具有抗氧化[4]、抗衰老[5]、改善肝功能[6]等生理活性。目前，山銀花的研究主要集中在種質資源評價[7]、產地差異[8-9]、初加工差異[10-11]、藥效與物質基礎的相關性[4]等方面，而關于其深加工及產品研發等方面則未見報道。

山銀花作為重要的原料，在制劑、保健食品、化工等領域具有重要的應用價值。一般采用山銀花提取物或者浸膏居多[12-13]，但本課題組研究發現，山銀花超微粉(全粉)對二甲苯致KM小鼠耳腫脹具有非常好的抗炎作用(需進一步探討揭示其機理)。超微粉碎是近年來食品原料學、生物技術、制劑及材料學方面的一項新技術，利用機械或流體動力的方法克服固體內部凝聚力使之破碎(達到100 μm以下)；食品原料超微粉碎后其營養成分、理化性能、功能活性及加工性能等方面均得到改善，不僅提高了物料粉體的溶解性、分散性、吸附性、化學反應活性等，甚至還可以將植物的不可食部分(如粗纖維等大分子)通過超微化被人體吸收，賦予產品細膩的口感[14-15]；食品原料的超微粉碎帶給它們更多獨特性能，將成為食品資源開發的重要手段和主流發展方向。國內外研究[14-15]均表明，超微粉碎是一種將物料轉變為易于生物轉化和水解的方法。盡管如此，未見有關超微粉碎對山銀花影響的報道。因此，本研究擬通過對山銀花進行不同粉碎(即普通粉碎和超微粉碎)，比較其微粒結構、活性成分(綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙、木犀草苷、咖啡酸等)含量、綠原酸溶出率和清除DPPH自由基(DPPH·)的差異，以期為山銀花的綜合利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮山銀花：忍冬科灰氈毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand. Mazz.)，采集于重慶秀山；

1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)：純度≥98%，美國Sigma-Aldrich公司；

溴化鉀：色譜純，天津市光復精細化工研究所；

綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙對照品：HPLC≥98%，中國藥品生物制品檢定所；

其他化學試劑：國產分析純；

所用水為雙蒸水，所用溶液均自行配制；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9240A型，海齊欣科學儀器有限公司；

三孔電熱恒溫水槽：DK-8D型，上海齊欣科學儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-2450型，日本島津公司；

多功能粉碎機：GX-04型，上海遠翔食品機械有限公司；

高頻振動式超微粉碎機：WZJ6型，濟南倍力粉技術工程有限公司；

激光粒度儀：Mastersizer 2000型，英國馬爾文malvern儀器有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Spectrum GX型，美國Perkin-Elmer公司；

中紅外DTGS檢測器：ALPAAI-4LSC型，美國Christ公司；

HPLC儀：2690-2995型，配蒸發光散射檢測器，美國Waters公司；

電子天平：CP-224S型，德國賽多利斯集團。

1.2 方法

1.2.1 普通粉碎和超微粉碎山銀花 原料清洗、去除雜質、干燥(時間24 h，55 ℃)；中藥粉碎機或超微粉碎(時間20 min)，過60目篩。

1.2.2 傅立葉變換中紅外光譜(FT-IR)、掃描電鏡(SEM)和粒徑分析方法

(1) FT-IR：采用溴化鉀壓片法。準確取0.30 g溴化鉀(色譜純)和0.03 g樣品粉末混勻后進行壓片；條件為壓力27 MPa，時間1 min；檢測條件：DTGS檢測器，光譜分辨率4 cm-1，掃描范圍4 000～450 cm-1；采用傅立葉變換中紅外光譜儀自帶的操作軟件采集及處理紅外圖譜。

(2) SEM：采用戊二醛將待測樣品進行固定，再用離子濺射儀對樣品表面進行鍍金，將其置于掃描電鏡下觀測形態，加速電壓為10 kV。

(3) 粒徑：采用激光粒度儀分別對山銀花超微粉和普通細粉末樣品進行粒度測定。

1.2.3 山銀花有效活性成分分析 綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙含量測定參照文獻[16]30；木犀草苷、咖啡酸含量測定參照文獻[16]221。

1.2.4 山銀花超微粉和普通粉中綠原酸的溶出度測定 采用槳法[17]。分別準確稱取山銀花超微粉和普通粉30 g，投入溶出儀中，避免產生氣泡，以超聲脫氣的900 mL超純水為溶出介質，轉速100 r/min，溫度為(37.0±0.5) ℃，立即啟動儀器，計時；分別于5，15，30，45，60 min各取樣2 mL，過0.45 μm 濾膜，得到以超純水為溶出介質的供試品溶液，HPLC測定綠原酸含量，同時向杯中補充相同溫度和體積的超純水，計算累計溶出率。

1.2.5 超微粉碎和普通粉碎對山銀花清除DPPH·能力的影響測定 準確稱取山銀花超微粉(LMUFP)、普通細粉(LMCP)各10.00 g，分別加入去離子水50 mL，混合均勻后置于50 ℃水浴中超聲波提取2 h，過濾，濾渣用同樣的方法提取1 h，混合2次濾液并蒸發濃縮，離心(5 000 r/min，5 min)后定容至100 mL，即得到100 mg/mL的樣品提取液，放置冰箱備用。按照Liu等[18]方法并略有修改，將不同濃度(10～50 mg/mL)的樣品提取物溶液3.0 mL與DPPH· 溶液1.0 mL(95%乙醇中配置，濃度為10-4moL/L)混勻后，于波長517 nm處測定吸光度(Ai)，同時，將DPPH·溶液1.0 mL 與樣品空白3.0 mL混勻后測定吸光度(Ac)，將不同濃度的樣品提取物溶液3.0 mL與95%乙醇溶液1.0 mL混勻后測定吸光度(Aj)，按式(1)計算DPPH·清除率：

(1)

式中：

s——DPPH·清除率，%；

Ai——樣品液組吸光度；

Aj——DPPH·空白組吸光度；

Ac——樣品空白組吸光度。

1.2.6 數據統計分析 采用SPSS 15數據處理軟件，各組數據結果均以平均值±SD(n=3)表示，并進行方差分析，最小顯著性差異檢驗(LSD)進行多重比較，P<0.05為差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 超微粉碎和普通粉碎對山銀花的顆粒結構和微觀形態的影響

山銀花超微粉和細粉的FT-IR圖譜如圖1所示，二者非常相似，表明超微粉碎對山銀花中各組分主要官能團及活性成分的結構影響較小；但與山銀花細粉相比，超微粉在3 407，2 919，2 360，1 629，1 047 cm-1等處的吸收峰均增強，說明粗多糖及纖維類特征吸收峰增強，可能是纖維素、半纖維素、木質素等大分子受到劇烈機械力作用，發生分子鏈斷裂現象，分子聚合度有減小趨勢，更多葡萄糖苷鍵、氫鍵等基團暴露；也可能是超微粉碎后粉體粒徑減小，相同條件下顆粒數目相對增多，暴露出更多的親水基團，使其吸收峰增強[19]。

A. 細粉 B. 超微粉

山銀花超微粉和細粉的掃描電鏡(SEM)如圖2所示。山銀花細粉形狀各異，粒徑較大，表面較粗糙。經過超微粉碎后，山銀花原片狀結構被切斷，呈現粒徑較小、形狀多為圓錐形或束形、纖維單個散在或數個成束的微粒結構特性。由圖3可知，經過普通粉碎的山銀花顆粒分布范圍較廣，平均粒徑為3 368 nm(分散系數PDI為0.817)，經過超微粉碎的山銀花顆粒平均粒徑為535.5 nm(分散系數PDI為0.540)。可見，經過超微粉碎后，其粒徑分布區域變窄。研究發現，超微粉碎通過剪切力改變了物料大小，未有效改變纖維的結晶結構，只是改變纖維的顆粒大小[20]。經超微粉碎后，粒徑減小，同時粉碎過程中纖維等大分子長鏈發生斷裂，使得羧基、羥基等基團充分暴露出來，從而改善其物化特性。

2.2 超微粉碎和普通粉碎對山銀花的有效活性成分含量的影響

山銀花超微粉和細粉的綠原酸、總皂苷(灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙)、木犀草苷、咖啡酸等有效活性成分含量見圖4；其中山銀花超微粉的綠原酸、總皂苷和咖啡酸含量顯著高于細粉(P<0.05)的；木犀草苷含量無顯著性差異。結果顯示，超微粉碎處理促進山銀花活性成分溶出。化學成分是藥效物質基礎，研究如何提高活性成分含量能夠更好地指導山銀花的綜合利用和成分提取[5-6]。Xiao等[21]研究發現超微粉碎可以提高茶葉粉中水溶性成分茶多酚、咖啡堿、多糖的含量，并認為是由于超微粉的粒徑減小，導致細胞壁破損率增加而提高了水溶性成分的溶出。

圖2 山銀花粉的掃描電鏡(SEM)

圖3 普通粗碎與超微粉碎對山銀花粉末粒徑的影響

*. 超微粉與細粉的活性成分之間差異顯著(P<0.05)

Figure 4 Effect of ultrafine and common grinding on the contents of effective compositions ofL.macranthoides

2.3 超微粉碎和普通粉碎對山銀花中綠原酸溶出度的影響

以蒸餾水為溶出介質，累計溶出量與測定的綠原酸含量之比即為累計溶出率。山銀花超微粉和細粉溶出數據見圖5，結果表明超微粉中綠原酸的溶出度和溶出速率與細粉相比均具有較明顯的優勢，原因主要歸結于超微粉具有良好的粒徑、比表面積和顆粒孔隙分布，超微顆粒的微觀結構變化影響了提取過程中植物化學物質的擴散過程，導致水提取物中可提取的小分子活性成分含量增加，從而提高了溶出量[22]。

2.4 超微粉碎和普通粉碎對山銀花抗氧化活性的影響

山銀花超微粉和細粉清除DPPH·能力對比如圖6所示。LMCP和LMUFP清除DPPH·能力都隨著質量濃度的增加而明顯增強，均呈劑量效應關系；LMUFP對DPPH·的清除作用要好于LMCP，尤其是在濃度增大時；超微粉清除DPPH·的能力是細粉的1.36倍(濃度均為60 mg/mL時)，說明山銀花超微粉抗氧化作用顯著高于細粉，與有效成分含量結果一致；原因可能是：① 超微粉碎破壞了原微粒的網狀致密結構，暴露出更多的親水基團，導致親水性增加，其清除DPPH·能力隨之提高[22]，這與FT-IR和SEM表征分析結果一致，均證實了超微粉碎對山銀花微粒結構的破壞作用[23]；② 超微粉碎破壞了山銀花的細胞壁及其內部網狀結構，造成更多的可溶性小分子活性成分溶出[24]，這與“2.2和2.3部分”的活性成分含量及其溶出數據一致。此外，傳統山銀花提取物或浸膏均采用高溫處理，而超微粉碎全過程均處于低溫狀態，有效防止了熱敏性成分及多酚的氧化和降解，具有更廣泛的應用前景。

圖5 山銀花超微粉和普通細粉中綠原酸的溶出曲線

Figure 5 The dissolution curve of chlorogenic acid of ultrafine and common grinding ofL.macranthoides

圖6 超微粉碎和普通粉碎對山銀花清除DPPH·能力的影響

Figure 6 Effect of ultrafine and common grinding on the DPPH· scavenging activity ofL.macranthoides

3 結論

超微粉碎使山銀花藥材的微粒結構(細胞壁及粗纖維結構)改變，提高了綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙、木犀草苷、咖啡酸等活性成分的溶出量及溶出速率，所以提高了其清除DPPH·的能力。通過山銀花粉末微粒結構結合活性成分及抗氧化能力評價，揭示了超微粉碎對山銀花全粉的影響，對山銀花的綜合利用和產品開發具有指導意義。目前山銀花的研究仍側重于化學成分與藥理作用的研究，將來研究的重點是開展山銀花系統研究，針對基原、不同產地、不同加工方法和產品研發及其綜合利用進行研究。因此，山銀花直接超微粉碎作為一種營養補充劑，替代山銀花提取物或者浸膏，在活性成分富集、抗氧化能力增強等方面具有較好的應用前景。