澳洲堅果蛋白夾心ELISA方法的建立及應用

賈增艷 王曉敏 沙志聰 周柔柔 生 威 張 燕

(1. 食品營養與安全國家重點實驗室﹝天津科技大學﹞，天津 300457；2. 天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；3. 天津市食品科學與健康重點實驗室﹝南開大學﹞，天津 300071；4. 南開大學醫學院，天津 300071)

堅果是八大類過敏原之一，其中澳洲堅果營養豐富，臨床試驗[1-2]表明，天然澳洲堅果、經烘焙加工的澳洲堅果都會引起患者不同程度的過敏反應，出現全身瘙癢、眼睛、嘴唇腫脹呼吸困難甚至暈厥等癥狀。Ekbote等[3]對過敏患者進行皮膚點刺試驗(SPT)發現，澳洲堅果中可能存在一種分子量約為17 kDa的主要過敏原；Herbst等[4]通過免疫印跡分析，報道了澳洲堅果中另2種過敏原蛋白，其分子量分別在12，45 kDa左右。過敏原的有效檢測是避免易致敏人群誤食過敏原的有效手段之一，當前研究最多、應用最廣泛的檢測方法是基于蛋白過敏原的酶聯免疫吸附分析法(ELISA)[5]和基于DNA的PCR檢測法[6-7]。Brezna等[8]建立了一種實時PCR方法，用于檢測食品中的澳洲堅果，檢測限為1.45 pg/mL，并通過14種樣品驗證PCR方法的實際適用性，此方法能夠靈敏地檢測食物樣品中的澳洲堅果，但并未報道是否適用于熱加工后的堅果中過敏原的檢測。經過熱加工后食物中的DNA會受損難以提取，極易造成PCR檢測結果的假陰性，因此PCR法檢測食物中過敏原會對檢測結果的準確性造成影響[9]。熱處理會使蛋白結構發生變化從而對與抗體的結合造成不同程度的影響。因此，基于抗原抗體特異性結合原理建立的ELISA方法應用于熱加工食品中過敏原蛋白的檢測也存在檢測適用性的難題。Maleki等[10]研究表明焙烤花生比生花生過敏原與IgE有更強的結合能力。劉珂等[11]研究表明加熱使得OVT、OVA、OVM蛋白結構發生變化，相比于未處理蛋白，與抗體結合能力減弱。不同的過敏原蛋白熱穩定性不同，對澳洲堅果蛋白在經過熱加工后的結構變化及過敏原的定量檢測尚未有報道。本研究擬針對澳洲堅果蛋白制備多克隆抗體，建立雙抗夾心ELISA方法，并對該方法應用于熱加工后的澳洲堅果及焙烤食品中的澳洲堅果蛋白的定量檢測進行評價，以期為加工食品中澳洲堅果過敏原的檢測提供有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

澳洲堅果(Macadamia integrifolia)：HAEA294，云南江城中澳農業科技發展公司；

大豆、核桃、榛果、杏仁、花生、開心果、腰果和小麥：市售；

免疫動物：3月齡雄性新西蘭白兔、6～7周齡雌性BALB/c小鼠，中國食品藥品檢定研究所；

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白(BSA)、羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP、Tris、甘氨酸、BCA蛋白定量試劑盒、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過氧化氫脲(CH6N2O3)、3,3,5,5-四甲基聯苯胺(TMB)、脫脂乳粉、魚皮膠、明膠、酶標穩定劑：含量≥99%，美國Sigma公司；

Tween 20：化學純，海浦東化工試劑廠；

β-環糊精、二甲基亞砜(DMSO)：化學純，德國Merck公司；

預制膠：12%，美國Bio-Rad公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

免疫親合層析柱：Protein A-Sepharose 4B、Protein G-Sepharose 4B型，美國Amersham公司；

蛋白純化儀：731-8300型，美國BIO-RAD公司；

酶標儀：F200 PRO型，美國Thermo公司；

磁力攪拌器：RH-KT型，德國IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 澳洲堅果蛋白的制備與驗證

(1) 除脂：將無殼生澳洲堅果仁充分研磨，用料液比為1∶20 (g/mL)的正己烷室溫下攪拌浸提16 h，經過0.45 μm 有機系纖維素膜過濾，收集果粉重復上述操作，揮發殘留的正己烷。將得到的堅果粉過50目篩，真空包裝后于-20 ℃保存備用。

(2) 提取：采用正己烷脫脂、堿提取(MAPI)方法提取澳洲堅果蛋白[12]，用去離子水溶解得到的蛋白沉淀冷凍干燥，將得到的蛋白質粉在-20 ℃保存備用[13-15]。

(3) SDS-PAGE：參照Zhang等[16]方法，對制備的澳洲堅果蛋白進行SDS-PAGE分析。

1.2.2 澳洲堅果蛋白的兔多克隆抗體制備 以所制備的澳洲堅果蛋白為免疫原對雄性新西蘭白兔進行免疫，2周免疫1次。初次免疫的乳化劑使用完全佐劑，免疫劑量1 mg/只，后4次增強免疫選擇不完全佐劑，免疫劑量0.5 mg/只。第2次免疫1周后開始耳部靜脈取血，第5次免疫結束1周后采股動脈全血，用IC-ELISA法測定血清效價，用Protein A-Sepharose-4B免疫親合層析柱純化獲得抗體[17]。

1.2.3 澳洲堅果蛋白鼠多克隆抗體的制備 選擇6～7周齡雌性BALB/c小鼠進行免疫。初次免疫時免疫原與弗氏完全佐劑1∶1體積混合乳化，每隔2周與不完全佐劑混合加強免疫，免疫劑量均為100 μg/只，第5次免疫結束1周后取全血，Protein G-Sepharose-4B免疫親合層析純化，于-20 ℃ 保存備用。

1.2.4 澳洲堅果蛋白雙抗夾心ELISA檢測步驟 將兔抗澳洲堅果蛋白抗體以100 μL/孔包被于96孔酶標板上，在4 ℃下孵育12 h后用PBST洗板3次，加封閉液(200 μL/孔)于37 ℃下封閉1 h。用PBST洗板3次，加入梯度稀釋的澳洲堅果蛋白溶液(100 μL/孔)，室溫下孵育1 h后PBST洗板4次。加入鼠抗血清(100 μL/孔)，室溫下孵育1 h后用PBST 洗板4次。將HRP標記的鼠二抗(100 μL/孔)加到酶標板上，室溫反應30 min后用PBST洗板5次，加入底物A和B的混合液(100 μL/孔)，37 ℃下顯色(15～20 min)，每孔加入50 μL硫酸終止液后在波長450～650 nm讀取吸光度值。以蛋白濃度為橫坐標，吸光度值(A450-A650)為縱坐標繪制標準曲線。檢出限(LOD)為A空白平均值±3SD對應的蛋白濃度，定量限(LOQ)為A空白平均值±10SD對應的蛋白濃度。

1.2.5 雙抗夾心ELISA檢測方法特異性的測定 選擇大豆、核桃、榛果、杏仁、花生、開心果、腰果和小麥8種常見過敏原，采用與澳洲堅果蛋白相同的方法制備相應的蛋白，采用建立的雙抗夾心ELISA方法進行檢測。PBS緩沖液作為陰性對照。樣品孔和陰性對照孔的吸光度值分別用P和N來表示。如果P/N>2，則表明樣品中的蛋白與抗體有交叉反應。

1.2.6 雙抗夾心ELISA檢測方法的應用 自制餅干，定量添加澳洲堅果，同時以不含澳洲堅果的餅干為對照，采用本研究建立的蛋白提取方法提取樣品中的澳洲堅果蛋白，采用建立的雙抗夾心ELISA方法檢測餅干中澳洲堅果過敏原蛋白的含量，按式(1)計算回收率：

(1)

式中：

P——回收率，%；

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C1——添加澳洲堅果蛋白樣品的檢測值，mg；

C0——未添加澳洲堅果蛋白樣品的檢測值，mg；

C2——澳洲堅果蛋白理論添加值，mg。

1.3 數據處理

所有試驗平行測定3次，利用統計學軟件SPSS 22.0對試驗結果進行方差分析(P<0.05)，用Origin 8.0繪制檢測方法的相關曲線圖。

2 結果與分析

2.1 澳洲堅果蛋白的驗證

將所制備的澳洲堅果蛋白(1 mg/mL)通過SDS-PAGE分析(圖1)，由圖1可見，澳洲堅果蛋白分子量主要分布在15～50 kDa 左右，其中分子量在20，45 kDa左右的蛋白含量較高，與Herbst等[4]研究結果一致。

M. 蛋白分子量標準參照 1. 澳洲堅果蛋白

2.2 雙抗夾心ELISA免疫檢測方法的建立

在以澳洲堅果蛋白為免疫原制備的兔多克隆抗體和鼠多克隆抗體基礎上，優化雙抗夾心ELISA免疫檢測條件。

2.2.1 捕獲抗體及封閉液的選擇 由于夾心ELISA方法檢出限與空白值大小密切相關，先對捕獲抗體和封閉液進行優化。將兔抗和鼠抗分別作為捕獲抗體包被于酶標板上，1 g/100 mL 的脫脂乳粉、BSA、魚皮膠、明膠、酪蛋白作為封閉液，檢測抗體分別為鼠抗和兔抗，測得空白的吸光度值見表1。

由表1可見，以兔多克隆抗體作為捕獲抗體時，采用不同封閉液的空白吸光度值均低于鼠抗，說明所制備的兔多抗的特異性要好于鼠多抗，以其為捕獲抗體時非特異性吸附較小，因此確定該方法的捕獲抗體為兔多抗，檢測抗體為鼠多抗，可在一定程度上提高檢測方法的靈敏度和特異性。同時，1 g/100 mL脫脂乳粉為封閉液時空白值最小，說明脫脂乳粉對酶標板上空余位點的封閉效果最好，且與鼠抗的非特異性吸附最弱，有助于提高檢測的靈敏度。因此選擇脫脂乳粉作為封閉液，并進一步優化封閉液濃度。

由表2可知0.5 g/100 mL的脫脂乳粉空白值最小，低濃度(0.1 g/100 mL)脫脂乳粉封閉的空白值比0.5 g/100 mL脫脂乳粉的大，可能是封閉液中蛋白濃度小導致未能完全封閉酶標板上未被捕獲抗體占據的空余位點，造成檢測抗體與空余位點結合的非特異性吸附；1.0 g/100 mL脫脂乳粉空白值最大，可能是濃度大使非特異性吸附增加所致。因此優化后的封閉液為濃度0.5 g/100 mL的脫脂乳粉。

表2 不同脫脂乳粉濃度下空白的平均吸光度值

2.2.2 捕獲抗體包被量的優化 將兔多克隆抗體作為捕獲抗體，分別稀釋至0.025，0.050，0.100 μg/孔進行包被，分別繪制標準曲線(圖2)。捕獲抗體的包被量對檢測方法的靈敏度有很大影響，捕獲抗體量越多，特異性結合的過敏原越多，因此會對待檢過敏原起到富集的作用，相應提高方法的靈敏度。但捕獲抗體過高，會造成非特異性吸附增加，使空白值增大，又會降低檢測靈敏度。因此捕獲抗體量需要通過試驗優化確定。結果表明，包被量為0.050，0.100 μg/孔時空白值相差不大且都具有良好的線性相關性，同時比0.025 μg/孔包被量在同一濃度蛋白對應的檢測吸光度值高，從節約抗體角度考慮，將捕獲抗體的包被量確定為0.050 μg/孔。

圖2 捕獲抗體包被量對澳洲堅果蛋白雙抗夾心酶聯免疫檢測方法的影響

Figure 2 Effect of coating quantity of capture antibody on macadamia nut protein sandwich ELISA

2.2.3 檢測抗體稀釋倍數的優化 固定優化后的捕獲抗體包被量和封閉液，將檢測抗體(鼠多抗)分別按1∶1 000，1∶1 500，1∶2 000，1∶2 500的比例進行稀釋，繪制標準曲線(圖3)。檢測抗體(鼠多抗)除與澳洲堅果蛋白過敏原發生特異性結合外，當其濃度過高時會使非特異性吸附增加造成空白值增大，降低特異性檢測的靈敏度。結果說明，1 000倍稀釋抗體所得到的空白值最高，而以1 500，2 000，2 500倍稀釋檢測抗體得到的空白值相差不大，以1∶2 000比例進行稀釋檢測抗體得到線性相關性最好，因此檢測抗體的最佳稀釋倍數確定為2 000。

2.2.4 酶標二抗稀釋倍數的優化 固定優化后的捕獲抗體包被量、封閉液和檢測抗體濃度，用PBS(pH 7.4，0.1 mol/L)緩沖液將羊抗鼠酶標二抗按1∶10 000，1∶20 000，1∶30 000 進行稀釋，繪制標曲，結果見圖4。羊抗鼠酶標二抗能特異性識別檢測抗體鼠多抗，利用二抗上結合的酶作為整個體系的檢測信號，理論上其濃度越大，催化酶底物產生的信號越強，方法越靈敏，但酶濃度過高時會導致蛋白類物質的非特異性結合，造成酶標二抗的非特異性吸附，會降低待測物與檢測信號間的線性相關性，因此酶標二抗濃度的優化非常關鍵。優化結果表明，以1∶20 000，1∶30 000稀釋時R2均接近于1，吸光度值無明顯差異，為節約抗體，選擇羊抗鼠酶標二抗的稀釋倍數為30 000倍。

圖3 檢測抗體稀釋倍數對澳洲堅果蛋白雙抗夾心ELISA的影響

Figure 3 Effect of detection antibody dilution factor on macadamia nut protein sandwich ELISA

圖4 酶標二抗稀釋倍數對澳洲堅果蛋白雙抗夾心酶聯免疫檢測的影響

Figure 4 Effect of dilution factor of enzyme labeled second antibody on macadamia nut protein sandwich ELISA

2.2.5 雙抗夾心ELISA法標準曲線的繪制 配制系列蛋白標準溶液，采用優化的分析條件進行檢測，以蛋白濃度作為橫坐標，吸光度值作為縱坐標繪制雙抗夾心ELISA檢測澳洲堅果過敏原蛋白的標準曲線(圖5)，計算得LOD值為 (0.95±0.17) ng/mL，LOQ值為(3.13±0.57) ng/mL。

2.2.6 雙抗夾心ELISA方法的特異性 為評價所建立方法的特異性，將大豆、核桃、榛果、杏仁、花生、開心果、腰果和小麥蛋白用PBS緩沖液分別配制成濃度分別為0.1，1.0，10.0 μg/mL 的蛋白溶液。以PBS緩沖液作為陰性對照，采用建立的澳洲堅果蛋白雙抗夾心ELISA方法測定，讀取相應的吸光度值，結果見表3。

圖5 澳洲堅果過敏原蛋白雙抗夾心酶聯免疫檢測方法

表3 雙抗夾心酶聯免疫檢測方法的特異性

從表3中可以看出，榛果和開心果蛋白與澳洲堅果抗體有較弱的結合反應，其他6種過敏原蛋白均無交叉反應。說明榛果蛋白和開心果蛋白與澳洲堅果蛋白具有相似的結構，與Sutherland 等[18]的研究結果一致。

2.3 雙抗夾心ELISA檢測方法的檢測穩定性

用PBS緩沖液稀釋澳洲堅果蛋白，濃度為30.0，16.0，8.0，4.0 ng/mL，以板內變異與板間變異對建立的雙抗夾心ELISA進行精密度測試。

將4個濃度的蛋白溶液在同一酶標板上分別進行5個平行測試，計算A450-A650的板內變異系數為3.36%～7.20%。相同條件綜合5 d測得的吸光度值，計算板間變異系數為3.83%～12.05%，均低于15%，說明該方法具有較好的穩定。

2.4 雙抗夾心ELISA方法的應用

2.4.1 烘焙加工處理對澳洲堅果蛋白提取率的影響 將澳洲堅果經170 ℃處理20 min，以未處理的生澳洲堅果作為對照樣品，探討常見焙烤條件對澳洲堅果蛋白提取率的影響，結果見表5。

澳洲堅果經170 ℃加熱處理后，蛋白得率顯著降低(P<0.05)，是未加工處理蛋白得率的90%左右，說明熱加工在一定程度上降低了蛋白提取率，可能是加熱改變了蛋白的結構，使蛋白溶解度降低。

2.4.2 餅干中澳洲堅果蛋白的測定 自制定量添加澳洲堅果的餅干，用堿溶酸沉法提取餅干中的澳洲堅果蛋白。用建立的雙抗夾心ELISA法進行測定，以未添加澳洲堅果的餅干為對照。根據表5蛋白得率計算澳洲堅果蛋白的理論添加量，以及焙烤餅干中可被提取的澳洲堅果蛋白的理論含量，按照式(1)分別計算回收率，結果見表6。

表4 澳洲堅果蛋白雙抗夾心ELISA檢測的板內及板間變異

表5 焙烤加工處理對蛋白提取率的影響?

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表6 雙抗夾心ELISA檢測餅干中澳洲堅果蛋白的添加回收率

不考慮熱加工處理對澳洲堅果蛋白得率的影響，以焙烤后的澳洲堅果蛋白理論含量計算，添加回收率為82.07%～85.49%，表明該方法用于澳洲堅果蛋白檢測的準確度較好。以未處理的澳洲堅果蛋白的理論添加量計算，添加回收率為73.67%～77.03%，回收率偏低的原因可能是熱加工使部分澳洲堅果蛋白的結構發生變化，導致樣品中蛋白提取率降低，另外空間結構的變化可能導致抗原表位變化，從而與抗體識別力下降，表現為ELISA檢測結果整體偏低。

3 結論

本試驗通優化封閉液、捕獲抗體的包被濃度，檢測抗體、酶標二抗的稀釋倍數，建立了澳洲堅果蛋白的雙抗夾心ELISA方法。選用抗體包被量為0.05 μg/孔，封閉液為0.5 g/100 mL 脫脂乳粉，檢測抗體稀釋倍數為2 000，羊抗鼠HRP-酶標二抗稀釋倍數為30 000，方法的最低檢出限為(0.95±0.17) ng/mL，定量限為(3.13±0.57) ng/mL，檢測線性范圍為3.13～30.00 ng/mL。測定結果的變異系數<12.05%，說明所建立的澳洲堅果蛋白雙抗夾心ELISA方法有良好的特異性與穩定性。該法應用于焙烤的澳洲堅果和餅干中澳洲堅果蛋白檢測，回收率較高，說明該方法適用于焙烤食品中澳洲堅果蛋白的定量檢測。