日本磯海綿共生真菌分離及其代謝產物抑菌活性研究

柴家樂 白雪蓮 鄭雙芝 盧甜甜 李曉菡 陳怡怡 吳丹丹

(杭州師范大學生命與環境科學學院，浙江 杭州 310016)

海綿具有特殊的濾食系統，可以使外界菌種在其體內和體表富集，成為共生真菌。海綿共生菌種屬復雜，種類多樣[1-2]。海綿共生真菌長期生活在宿主體內的特殊環境中，并與宿主協同進化，在演化過程中二者形成了互惠共生的關系，因此可能產生與宿主相同或相似的活性次級代謝產物[3-4]。國內外對植物共生真菌的研究報道[5-6]較多，例如已利用紫杉共生真菌發酵生產紫杉醇，該物質為良好的抗腫瘤藥物。但是對動物共生真菌的研究[7-8]相對較少，關于海綿的就更少。孟慶鵬[9]曾對海綿菌中可培養的共附生微生物進行研究，發現在4種海綿中有85株共生細菌，并對其功能基因進行了篩選，但未對其共生真菌進行研究。吳琦等[10]對南海海綿共生真菌Emericellav variecolor XSA-07-2的代謝產物結構及活性進行研究，采用色譜分離技術共鑒定出14個新化合物，體外生物活性篩選試驗表明，部分多烯α吡喃酮衍生物表現出抗流感病毒和抗腫瘤活性。Sou 等[11]純化獲得48種海綿相關微生物，測定了各品種液體培養的乙酸乙酯提取物的細胞毒性、溶血活性和蝦的致死活性。

近年來，致瀉大腸埃希氏菌引起的食源性疾病日益受到人們的關注，其引發的出血性腸炎的暴發或散發性病例較為常見，每年約有2.8～4.0億例人源產腸毒素大腸桿菌感染發病，約造成30～50萬人死亡[12]。目前對大腸桿菌所引起的疾病多采用有效的抗生素進行治療。抗生素的廣泛持續使用和不當使用導致大腸桿菌耐藥株的不斷增多，使臨床對大腸桿菌病的治療變得十分困難，有時甚至找不到可治之藥。鑒于此，本課題組以日本磯海綿為試材，采用3種培養基通過劃線分離法進行共生真菌的分離，利用形態學觀察結合分子生物學檢測方法對其進行分類鑒定，以大腸桿菌為受試菌株，對分離獲得的海綿共生菌的次級代謝產物進行抑菌活性研究，以期為海綿資源的有效利用和大腸桿菌新的抑菌活性物質的開發提供新方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品的采集

日本磯海綿：采自大連星海灣，采樣后立即裝入采樣袋于4 ℃保藏運送至實驗室進行試驗。

1.1.2 試劑

海水配制：將氯化鈉26.518 g、氯化鎂2.447 g、硫酸鎂3.305 g、氯化鈣1.141 g、氯化鉀0.725 g、碳酸氫鈉0.202 g、溴化鈉0.083 g分別溶解至蒸餾水中，混合，定容至1 000 mL[13]；

培養基：馬鈴薯葡萄糖肉湯固體培養基(PDA培養基)、馬丁培養基、營養肉汁瓊脂培養基、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(BYP)；

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli1.2812)：中國微生物菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將冷凍保藏的樣品進行自然解凍，去除雜質，用無菌水對海綿表面進行反復清洗3～5次。將最后1次清洗液涂布于PDA培養基上，28 ℃恒溫培養3 d，觀察是否長菌，如未長菌即可開展后續試驗。

1.2.2 日本磯海綿共生真菌分離 用無菌剪將海綿組織剪成小塊，置于100 mL無菌水中充分震蕩，靜置5 min，吸取200 μL上述溶液分別涂布于PDA培養基(蒸餾水配制)、PDA培養基(海水配制)、馬丁培養基(海水配制)上，靜置，使溶液滲入培養基中，倒置于恒溫培養箱中28 ℃培養，觀察菌落生長情況。待形成明顯菌落的時候，利用劃線分離法進行分離，直至獲得單一菌種。

1.2.3 共生真菌形態學觀察

(1) 菌落形態觀察：將分離得到的菌種，采用點植法接種于其對應的培養基上，28 ℃恒溫培養。每天觀察和記錄菌落生長狀況，拍攝菌落圖片。

(2) 共生真菌顯微形態觀察：將菌株通過劃線分離法接種于培養基上，垂直于劃線方向，用無菌鑷子將滅菌后的蓋玻片斜插入培養基中，將培養皿于28 ℃恒溫培養，直至菌絲長至蓋玻片約1/2處，取出蓋玻片，放在滴有無菌水的載玻片上，觀察磯海綿共生真菌的顯微形態。

1.2.4 共生真菌分子生物學鑒定 將分離的純菌種送至上海桑尼生物有限公司進行rDNA ITS測序，首先提取DNA，然后進行PCR擴增，引物設計見表1，PCR擴增反應體系見表2，在PCR擴增儀上進行PCR反應，反應程序為預變性：95 ℃，5 min；變性：95 ℃，30 s；退火：58 ℃，30 s；延伸：72 ℃，1 min；終延伸：72 ℃，7 min；循環數：35。反應完成后，取3 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。確認PCR擴增片段。取各個菌種純化后的PCR產物，使用測序儀進行DNA測序。最后進行序列分析，利用BLAST搜索軟件將測序結果與GenBank數據庫中相關真菌菌株的序列進行比對，獲得相似性序列，再用DNAMA9.0軟件進行鄰接法(Neighbor Joining)聚類系統發育分析，從而確定菌種的分類地位。

表1 引物設計

表2 PCR擴增反應體系

結合菌落形態、顯微形態、分子鑒定結果，參照文獻[14]確定菌株的分類學地位。

1.2.5 共生真菌代謝產物的抑菌活性研究

(1) 共生真菌代謝產物制備：將各菌株接種于2 L與其對應的液體培養基中，28 ℃，100 r/min條件下，恒溫培養7～14 d。發酵液離心(8 000 r/min，10 min)，收集上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，將乙酸乙酯合并后減壓濃縮至干，稱重，用二甲基亞砜(DMSO)溶解備用。

(2) 抑菌活性測定：以大腸埃希氏菌為測試菌株，用BYP培養液在37 ℃恒溫搖床上培養3 d。采用血球計數板計數，當菌懸液中細菌濃度為1×105個/mL時采用96孔板微量法測定抑菌活性。試驗組每孔加入90 μL菌懸液(1×105個/mL)，加入10 μL代謝產物溶液(DMSO為溶劑，按照3.5.1制備)，5孔為一組，做2組平行。以DMSO為陰性對照，以100 mmol/L青霉素溶液為陽性對照。加樣完成后，在37 ℃，100 r/min條件下，置于恒溫搖床中培養。以12 h作為一個測定周期，在600 nm波長下測定OD值。按式(1)計算抑制率。

(1)

式中：

c——抑制率，%；

OD1——陰性對照組吸光值；

OD2——試驗組吸光值。

1.3 數據處理

所有數據均以3個獨立樣本的x±SEM表示。采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，數據進行方差分析后，用Student’s t檢驗進行2組之間的比較，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 日本磯海綿共生真菌的分離與鑒定

從日本磯海綿中共分離到33株共生真菌，其中采用PDA培養基(蒸餾水)分離到21株，PDA培養基(海水)分離到7株，馬丁培養基(海水)分離到5株。通過對各菌種的菌落形態觀察、顯微形態觀察以及分子生物學鑒定結果分析可知，磯海綿共生真菌分別屬于4個屬：青霉屬、曲霉屬、絲衣霉屬、紅酵母屬。其中L18、L19屬于青霉屬，P7屬于紅酵母屬，L2、L15未能確定其菌種分類地位。具體情況如表3所示。

由表4可知，青霉屬和曲霉屬的真菌是海綿共生菌的優勢菌，二者分離頻率之和達87.9%，其中M1呈現典型的青霉菌的菌落形態特征，菌落呈綠色，生長速度快，菌落致密，與L9菌落形態相似，但菌落背面呈橙色，具體種屬還需進一步鑒定。M4等8株菌為曲霉屬，菌絲向空中不斷伸長，生長速度也較快，有些呈黃色，有些呈白色。海綿共生真菌種類多，具有微生物多樣性的特點。典型海綿共生真菌菌落圖片和顯微形態見圖1、2。

表3 不同培養基共生真菌分離情況

2.2 分子生物學鑒定及聚類分析

將共生真菌測序結果輸入NCBI數據庫中進行BLAST比對，將有最高比對度的菌株及匹配編號列于表5中。共生真菌序列與比對后獲得相似度較高的菌株序列，錄入DNAMA9.0軟件進行聚類分析，采用鄰接法(Neighbor Joining)構建系統發育樹。結果表明，共生真菌分為4個屬：青霉屬、曲霉屬、酵母屬、絲衣霉屬。據菌落形態特征和顯微形態特征及聚類分析可知，L1是桔青霉，M3是雜色曲霉。其中L2、L15、L18、L19、P7與NCBI數據庫中的菌種的序列同源性<50%，不能確定其種屬。

表4 共生真菌形態特征

圖1 部分共生真菌菌落形態特征

圖2 部分共生真菌顯微形態(放大倍數均為400倍)

2.3 共生真菌的抑菌活性

采用96孔板法測定各菌株代謝產物的抑菌活性，發現L2、L7、M1、M3、M4、P7對于大腸埃希氏菌表現出一定的抑制效果(見表6)。

從表6可知，33株海綿共生真菌中有7株具有抑菌活性。本試驗以12 h為檢測周期，培養24 h后有7株共生真菌次生代謝產物有一定的抑菌活性，其中M3對大腸桿菌的抑制作用最強，抑制率達(56.66±2.28)%，其次是M1，抑制率為(51.23±6.24)%，二者均高于陽性對照。共生真菌M4的抑制率隨時間延長而增強，48 h達最強，為(41.69±6.33)%。其它菌抑菌活性未呈時間依賴性。

3 結論

試驗共分離獲得33株海綿共生真菌，分子鑒定結合形態觀察確定青霉屬和曲霉屬真菌為海綿共生真菌的優勢菌。

表5 NCBI數據庫匹配結果

表6 各菌種次生代謝產物對大腸埃希氏菌的抑制效果?

? “-”表示無抑制作用；同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

其中L1是桔青霉，M3是雜色曲霉。針對大腸埃希氏菌進行抑菌活性試驗發現，M3等7株共生真菌代謝產物抑菌活性強，具有良好的研究潛質。今后還將利用色譜技術分離和鑒定其化學組成和分子結構，為開發新的抑菌活性物質提供新化合物。此外，試驗共分離獲得33株海綿共生真菌，菌株數量有限，后續試驗還可以通過增加分離培養基種類等方法，進一步挖掘海綿共生真菌資源。