馬尾藻巖藻聚糖分離純化及對HepG2細胞膽固醇含量的影響

劉海韻 諶素華,2 王維民 黃娟娟 廖森泰

(1. 廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088；3. 廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東 廣州 510610)

中國馬尾藻資源豐富，主要分布在西沙群島、南沙群島、硇洲島、海南島、潿洲島等海域中，且分布在近海岸，易獲得[1]。巖藻聚糖是馬尾藻的主要活性物質，具有降血脂[2]、抗氧化[3]、抗癌[4]、抗腫瘤[5]、抗病毒[6]、抗凝血[7]、抗血栓[8]、提高免疫力[9]等作用，其生物活性與硫酸根的位置及數量有直接的關系[10]。有研究表明海藻中提取的巖藻聚糖可以有效地降低血清中膽固醇含量，如Park等[11]研究表明巖藻聚糖通過調節SREBP-2以調節肝臟中膽固醇和甘油三酯合成的關鍵酶的表達來改善血清脂質水平；Uehara等[12]研究表明ATP結合盒轉運子ABCA1是細胞內膽固醇逆轉運的重要調節因子，也是促進膽固醇逆轉運(RCT)過程中的關鍵轉運體和受體，主要介導血管壁上的巨噬細胞或其他細胞內的膽固醇及磷脂流出，促進RCT，調節脂代謝紊亂；諶素華等[13]通過建立高脂血癥小鼠模型，研究了馬尾藻巖藻聚糖對脂代謝相關酶和膽固醇合成關鍵酶的影響，研究表明巖藻聚糖能夠顯著增加血清卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)、肝脂酶(HL)、脂蛋白脂酶(LPL)和肝臟LCAT、LPL活性，增加脂蛋白代謝的關鍵酶，加速總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)的分解代謝，或通過抑制膽固醇合成酶HMG-CoA還原酶降低膽固醇的合成。

采用常規水提方式提取巖藻聚糖的分子量較大，不易被生物吸收利用，其活性也往往不佳[14]，所以將純化的巖藻聚糖降解后再進行相關活性研究越來越受到關注。蔡璐[15]1-2采用酸降解法獲得了低分子量的巖藻聚糖組分，并且用于小鼠的體內試驗。但酸降解法有污染較重、反應條件難以控制、硫酸基損失較大且降解結束后必須純化以除去酸等不足[16]，不利于進一步的活性研究，所以本研究擬采用污染小、更高效、硫酸基保護效果優異[17-18]的基于過氧化氫-抗壞血酸體系的自由基氧化降解法[19-20]得到低分子量的巖藻聚糖。本研究擬采用體外培養細胞的方式探討各不同組分對HepG2細胞膽固醇含量的影響，以期與小鼠體內試驗形成相互對照。由于動物體內的脂質代謝途徑十分復雜，不確定因素太多，所以并不能僅僅依靠小鼠體內試驗就能完全定論巖藻聚糖具有良好的降血脂活性，還需要體外細胞試驗來進一步論證。所以還采用不同分子量的巖藻聚糖，以期使試驗結果具有更多的延展性，能夠更為全面地論證巖藻聚糖的降血脂活性。本研究旨在為治療高膽固醇病癥提供一定的理論基礎，同時為馬尾藻資源利用及巖藻聚糖生物活性開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

亨氏馬尾藻：2017年3月采摘于廣東湛江硇洲島海域，將采摘的亨氏馬尾藻除去爛葉、黃葉、根等不可食部分，反復用自來水沖洗干凈，在50 ℃烘干后粉碎，過80目篩，干燥后裝袋貯藏備用；

HepG2人體肝癌細胞：北納創聯生物技術有限公司；

DEAE C-52纖維素、BCA蛋白濃度測定試劑盒：北京鼎國昌盛生物科技有限公司；

Superdex 75葡聚糖凝膠：美國通用電氣公司；

DMEM培養液、FBS(胎牛血清)、PS(雙抗)、PBS磷酸緩沖液、DMSO(二甲基亞砜)、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液、MTT(噻唑藍)：西格瑪奧德里奇公司；

組織總膽固醇試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：AW120型，日本島津公司；

真空冷凍干燥機：FD8508型，韓國Ilshin公司；

CO2培養箱：MC0175型，日本三洋電機株式會社；

智能型倒置熒光顯微鏡：DMI4000B型，德國徠卡微系統有限公司；

全自動酶標儀：Varioskan Flash型，美國熱電公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗多糖的制取 將過篩后的馬尾藻粉按料液比1∶30(體積比)配成溶液，以60 ℃、350 W超聲50 min，然后在80 ℃的恒溫水浴浸提3.5 h。棄去沉淀，45 ℃旋轉蒸發濃縮。加乙醇至體積分數為30%，濾除沉淀；繼續加乙醇至體積分數為80%，取沉淀用丙酮和無水乙醇交替洗滌各2次。將沉淀用少量水溶解，按多糖溶液∶Sevag試劑=5∶1(體積比)的比例加入Sevag試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比)進行脫蛋白。透析并真空冷凍干燥[15]13得粗多糖。

1.2.2 DEAE C-52纖維素陰離子交換層析 將DEAE C-52纖維素用蒸餾水清洗干凈，裝入2.6 cm×60 cm的玻璃層析柱，至距離柱頂約5 cm處時停止裝柱，以蒸餾水平衡柱子。稱取200 mg粗多糖溶于20 mL蒸餾水，依次用蒸餾水和1.3，2.3，3.0 mol/L NaCl 進行分級洗脫。流速為1 mL/min，分步收集(5 mL/管)，以硫酸—苯酚法在490 nm處跟蹤檢測，分別收集洗脫峰，直至無糖組分流出，依吸光度對洗脫液管號作圖，得到洗脫曲線。合并相同峰位組分，透析48 h除鹽，45 ℃ 旋轉蒸發濃縮，真空冷凍干燥[21]13得到HF0、HF1、HF2和HF3，其得率分別為13.98%，67.80%，17.04%，0.24%。

1.2.3 過氧化氫—抗壞血酸體系氧化降解 稱取回收率最高的HF1組分300 mg，加入20 mL蒸餾水溶解，于30 ℃的恒溫水中加入0.103 6 g抗壞血酸，邊攪拌邊加入2%的過氧化氫1 mL，另稱取300 mg的HF1，加入20 mL蒸餾水溶解，于30 ℃的恒溫水中加入0.259 0 g抗壞血酸，邊攪拌邊加入5%的過氧化氫1 mL，加完后開始攪拌計時，反應2 h后3 600 r/min離心10 min，棄沉淀，透析72 h后經45 ℃旋轉蒸發濃縮，真空冷凍干燥[21]13得到HDF1和HDF2。

1.2.4 Superdex 75葡聚糖凝膠層析 將Superdex 75葡聚糖凝膠用蒸餾水清洗干凈，裝入1.6 cm×80 cm的玻璃層析柱，至距離柱頂約5 cm處時停止裝柱，以已過0.22 μm微孔濾膜的0.5 mol/L NaCl平衡柱子。將得率較高的HDF2用適量蒸餾水溶解，以已過膜的0.5 mol/L NaCl為洗脫液，洗脫速度為6 s/滴，每管收集3 mL，用苯酚—硫酸法測定吸光值，確定峰的變化，收集同一峰的多糖組分，經過透析、45 ℃旋轉蒸發濃縮、真空冷凍干燥[21]14得到HDF21和HDF22。

由于HF0為中性多糖組分，無理想生物活性，HF2、HF3回收率不高，HDF2全部用于了Superdex 75葡聚糖凝膠層析。所以本研究最終選擇HF1、HDF1、HDF21和HDF22 4種組分做進一步研究。

1.2.5 化學成分分析

(1) 多糖含量測定：苯酚—硫酸法[22]。

(2) 硫酸基含量測定：氯化鋇—明膠比濁法[23]。

(3) 巖藻糖測定：半胱氨酸鹽酸鹽法[24]。

(4) 葡萄糖醛酸含量測定：改良的咔唑比色法[25]。

1.2.6 HepG2細胞培養試劑配置

(1) 完全培養液：89% DMEM+10% FBS+1% PS。

(2) 細胞凍存液：50% DMEM+40% FBS+10% DMSO。

(3) 5 mg/mL MTT：稱取25 mg MTT溶于5 mL PBS緩沖液中，避光，晃動一段時間后置于超聲波中使其充分溶解，-20 ℃保存，使用前用完全培養基稀釋成0.5 mg/mL。

(4) 2 mg/mL多糖母液：分別稱取10 mg HF1、HDF1、HDF21和HDF22溶于5 mL DMEM中，濃度為2 mg/mL，置于4 ℃下保存備用，試驗前用DMEM稀釋成需要的濃度，過0.22 μm針式濾膜。

1.2.7 HepG2細胞的復蘇、培養、傳代及凍存

(1) 細胞復蘇：取出細胞凍存管，放入流動的37 ℃水中，期間不斷搖晃使細胞凍存液融化。加入適量的完全培養液，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入適量的完全培養基后移入培養瓶中，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，次日更換培養基繼續培養，并觀察細胞形態。

(2) 細胞傳代培養：從培養箱中取出細胞培養瓶，用酒精噴在培養瓶表面消毒后，在倒置顯微鏡下觀察到細胞匯合度在70%～80%時即可進行細胞傳代，在超凈工作臺中操作，棄去培養瓶中舊的培養液，加入 0.01 mol/L PBS緩沖液1 mL，洗滌細胞2次，吸出PBS緩沖液。再加入0.25%的胰蛋白酶2 mL，于培養箱中消化3 min，觀察細胞形態，此時細胞質回縮變圓，細胞間隙變大即可加入2 mL完全培養液終止消化。將細胞懸液轉移到15 mL離心管中，1 500 r/min 離心5 min，棄去上清液，按一定的比例加入完全培養基吹打均勻，取10 μL于計數板上計數，按計數結果進行稀釋，分裝到新的培養瓶中靜置培養。

(3) 細胞凍存：選擇處于對數生長期的細胞，更換新的培養液培養過夜，次日將細胞進行消化，終止消化后，轉移到15 mL離心管中，1 500 r/min 離心5 min，棄去上清液，按比例加入細胞凍存液，吹打搖晃均勻。每管吸取1 mL分裝到凍存管中，標好日期和名稱后分別于4 ℃冷凍30 min、-20 ℃ 冷凍1 h，最終在-80 ℃凍存。

1.2.8 MTT法制作HepG2細胞生長曲線 在倒置顯微鏡下觀察到細胞匯合度在80%左右時將細胞消化處理，然后用完全培養基將細胞濃度調整為5×104個/mL接種在96孔板上于培養箱內培養，每天同一時間取豎排的8孔細胞進行MTT法處理，得到OD值，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.9 不同濃度組分及其對HepG2細胞膽固醇含量的影響 將多糖樣品HF1、HDF1、HDF21、HDF22分別設2個濃度組，低濃度組(125 μg/mL) 和高濃度組(500 μg/mL)，并設立空白組。

(1) 細胞鋪板：將處于對數生長期的細胞消化制成細胞懸液，稀釋成1×105個/mL，接種在6孔板中，每孔2 mL 3組平行，于培養箱中培養。

(2) TC含量的測定：待細胞匯合度達60%～70%時，棄去舊的培養液，用PBS洗2次后加入DMEM稀釋的多糖組分2 mL，分別培養24，48，72 h后棄去培養液，用PBS洗2次，再分2次加入1 mL PBS溶液，用刮板把6孔板中的細胞完全轉移到1.5 mL離心管中。于1 000 r/min 離心5 min后棄上清液，加入膽固醇試劑盒中100 μL的細胞裂解液，旋渦震蕩30 s后靜置5 min，反復3次共裂解25 min；于1 500 r/min 離心5 min，取上清液。

(3) 配制工作液：R1與R2體積比為4∶1，混勻，立即使用。

(4) 標準品稀釋：將5 mmol/L膽固醇標準品用無水乙醇稀釋為1 250.0，625.0，312.5，156.0，78.0，39.0 μmol/L。取10 μL于96孔板中，并設立空白對照組，3個平行；分別取10 μL 待測樣品加入96孔板中，3組平行，每孔加入190 μL工作液，充分搖勻，37 ℃反應20 min后于550 nm處測OD值。由標準曲線計算出各樣品中膽固醇含量。

1.3 統計學分析

2 結果與分析

2.1 亨氏馬尾藻巖藻聚糖化學組成

由表1可以看出，經過分離純化和降解，HDF1的多糖含量、硫酸基含量和巖藻糖含量均高于HF1，但糖醛酸含量低于HF1。降解后的HDF1的多糖含量升高了14.14%。HDF21、HDF22的多糖含量分別降低了6.77%和8.80%，硫酸基含量分別降低了1.20%和5.88%。 HDF22的巖藻糖含量降低了5.02%，HDF21的糖醛酸含量降低了6.98%，但HDF21的巖藻糖含量有明顯的升高，提高了9.47%。因此，從數據來看，降解作用對HDF21的化學組成影響最大。

表1 亨氏馬尾藻巖藻聚糖不同組分的化學組成

2.2 HepG2細胞生長狀況

由于該細胞為肝癌細胞，生長速率快，由圖1可以看出，細胞在48～72 h處生長最快，處于對數生長期，而培養開始及培養后期OD值變化不大，這是因為細胞在最初數量較少，且處于適應環境的過程，培養一段時間之后，由于營養充足，細胞增長很快，后期由于營養物質的消耗及代謝產物的增多，細胞增長緩慢。

2.3 馬尾藻巖藻聚糖不同組分對細胞內膽固醇含量的影響

由圖2可知：細胞培養24 h后，與空白組相比，不同組分不同濃度的巖藻聚糖均能不同程度地降低細胞內膽固醇含量。其中HF1和HDF1在濃度為125 μg/mL時能極顯著降低(P<0.01)HepG2細胞內膽固醇含量。而當HF1的濃度處于500 μg/mL，HDF21的濃度處于125 μg/mL時，也能顯著降低(P<0.05)細胞內膽固醇含量。

細胞培養48 h后，與空白組相比，只有HF1濃度為500 μg/mL 時才能極顯著降低(P<0.01)細胞內膽固醇含量(降低了57.57%)；HF1、HDF1在濃度處于125 μg/mL，HDF22濃度處于500 μg/mL時能顯著降低(P<0.05)細胞內膽固醇含量。其他組膽固醇水平雖然低于空白組，但是沒有顯著差異。

圖1 HepG2細胞生長曲線

圖2 不同組分及濃度巖藻聚糖硫酸酯對細胞內膽固醇水平的影響

Figure 2 Effects of different components and concentrations of fucoidan sulfate on intracellular cholesterol levels

細胞經培養72 h后，與空白組相比，巖藻聚糖各個組分、各個濃度均能明顯降低細胞內膽固醇含量。當濃度處于125 μg/mL時，除了HDF21作用的細胞膽固醇含量沒有明顯變化外，HF1、HDF1、HDF22處理的細胞膽固醇含量均有顯著性降低(P<0.05)；而HF1、HDF1、HDF21和HDF22 4種組分的高濃度組(500 μg/mL)均能極顯著降低(P<0.01)細胞內膽固醇含量，分別降低了44.14%，57.64%，61.21%，54.09%。

綜上所述：與空白組相比，HF1、HDF1、HDF21和HDF22 4種組分在低濃度和高濃度分別作用細胞24，48，72 h 后均能降低細胞內膽固醇含量，其中作用72 h時降膽固醇作用最佳。從圖2(c)來看，濃度為500 μg/mL時的HDF21降膽固醇的效果最好，降低了61.21%；其次為HDF1，降低了57.64%。同一組分的高濃度樣品效果好于低濃度，因此可以看出巖藻聚糖的降膽固醇作用不僅與時間有關還與濃度有關。

3 結論

將亨氏馬尾藻粉依次進行超聲波輔助熱水浸提、乙醇分級沉淀、Sevag法脫蛋白、透析并真空冷凍干燥后得粗多糖，采用DEAE C-52分級純化得到HF1，經自由基氧化降解得到HDF1、HDF2，HDF2經Superdex 75分離純化得到HDF21、HDF22。分析了HF1、HDF1、HDF21、HDF22的化學組成：多糖含量分別為35.13%，49.27%，28.36%，26.33%；硫酸基含量分別為16.35%，17.52%，15.15%，10.47%；糖醛酸含量分別為12.53%，10.85%，5.55%，12.84%；巖藻糖含量分別為15.34%，17.52%，24.81%，10.32%。

研究了4種不同分子量的巖藻聚糖HF1、HDF1、HDF21和HDF22對HepG2細胞膽固醇含量的影響。結果表明，4種組分作用細胞后均能降低膽固醇含量，特別是4種組分的高濃度(500 μg/mL)作用72 h均能極顯著降低(P<0.01)細胞內膽固醇含量，HF1、HDF1、HDF21和HDF22組分別降低了44.14%，57.64%，61.21%，54.09%。這表明巖藻聚糖對HepG2細胞內膽固醇水平的影響可能具有一定的時效與量效關系，且4種組分中HDF21降膽固醇效果最好，可能與其分子量較低及糖鏈上的巖藻糖含量較高有關。

本研究采用細胞體外培養方式，通過檢測細胞內膽固醇含量探究了巖藻聚糖的降血脂活性。但由于脂質代謝的復雜性，巖藻聚糖的降血脂機理尚不清楚，后續試驗可以在巖藻聚糖的結構解析和細胞分子生物學的層面上作進一步的探究。