miRNA調控植物抗逆機制的研究現狀

李昕晏 崔杰 李俊良 王琮玉 羅成飛

摘要：逆境脅迫會對植物的生長發育產生負面影響，在漫長的進化中，植物擁有了一套復雜的調控網絡以應對不良環境，在這一套調控網絡中miRNA起到了重要作用。本文對近幾年關于miRNA及其靶基因調控作用的研究進行了總結，并對miRNA的形成過程和作用機制進行了概括，介紹了與抗逆相關的miRNA及其靶基因，包括以靶基因為抗逆相關轉錄因子的miRNA（miR160/miR167、miR159、miR156和miR164）以及以靶基因為抗逆相關結構基因的miRNA（miR398和miR395），可為利用基因工程手段增強植物的抗逆性提供更有效的改良途徑。

關鍵詞：miRNA;逆境脅迫;轉錄因子;結構基因;靶基因

中圖分類號： S332.1;S184文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0063-04

收稿日期：2018-09-28

基金項目：國家自然科學基金（編號：31571731）。

作者簡介：李昕晏（1995—），女，湖南長沙人，碩士研究生，主要從事植物抗逆分子生物學研究。E-mail：496349958@qq.com。

通信作者：崔杰，博士，副教授，主要從事植物抗逆分子生物學研究。E-mail：cuijie2006@163.com。

1miRNA概述

microRNA（miRNA）是小的非編碼內源性RNA（18～24個核苷酸），首先在線蟲（Caenorhabditis elegans）中被發現，可在突變的秀麗隱桿線蟲中暫時表達，所以miRNA最初被稱為短時間RNA（stRNA）[1]。植物miRNA是一類內源性非編碼小RNA，對植物生長發育至關重要。植物miRNA主要經過以下幾個過程產生：首先編碼miRNA的基因依賴RNA聚合酶Pol Ⅱ復合體形成長約1 000 bp的初級轉錄物，初級轉錄物呈現不完全配對的莖環結構，隨后初級轉錄物轉變為成熟的miRNA，該過程需要經過2個步驟，第1步在細胞核中進行，蛋白酶DCL1識別莖環結構并對其進行切割，形成前體miRNA，前體miRNA通過HASTY轉運蛋白轉運到細胞質中;第2步在細胞質中進行，ATP依賴性RNase Ⅲ蛋白Dicer識別前體miRNA的2 nt 3′突出端，并從其末端去除約21 nt序列形成成熟的miRNA-miRNA*雙鏈體[2]。接著成熟的miRNA雙鏈體展開形成22 nt的單鏈成熟miRNA，其與Argonaute蛋白-1（AGO-1）以及其他調節蛋白如GW182和聚A結合蛋白（PABP）一起形成RNA誘導沉默復合物（RISC）。最后，成熟的miRNA沉默復合體（RISC）通過與靶mRNA轉錄物3′端非翻譯區（3′UTR）中的區域進行堿基互補配對導致靶mRNA翻譯抑制或降解。靶mRNA被抑制還是被降解取決于其與同源miRNA序列的互補程度。在動物中miRNA與靶mRNA的相互作用是部分互補，會導致蛋白質翻譯被抑制，而在植物中是完全互補，會導致靶基因完全降解[3-4]。

2miRNA在植物抗逆過程中的作用方式

2.1通過靶向應激相關轉錄因子抗逆

研究表明，一些miRNA的靶基因可翻譯為與應激相關的轉錄因子[5-7]。轉錄因子是一種蛋白質，它能夠與下游靶基因啟動子區域中的順式作用元件發生特異性結合，激活或抑制基因的表達。轉錄因子一般有4個保守的功能區，分別為DNA結合域、轉錄激活或抑制結構域（轉錄調控域）、寡聚化位點和核定位信號。但并不是所有的轉錄因子都具有以上所有的功能區，有些轉錄因子沒有寡聚化位點。DNA結合域能夠識別并結合特定的順式作用元件，其氨基酸序列的特異性決定了轉錄因子能夠結合的順式作用元件的特異性。轉錄調控域是轉錄因子家族的分類依據，同一類轉錄因子家族擁有相似的轉錄調控區域，根據對靶基因作用的差異可將其分為轉錄激活域和轉錄抑制域。寡聚化位點的存在是轉錄因子發生相互作用形成同源或異源二聚體的條件。核定位信號是富含精氨酸和賴氨酸殘基的核定區域，轉錄因子通過該區域的調控進入細胞核[8]。植物中的轉錄因子數量眾多，且廣泛地參與植物生長發育過程，其中一部分轉錄因子與抗逆有關，能夠在植物受到脅迫時被脅迫信號激發，與特定基因的啟動子結合，調控其表達從而引起植物發生生理生化變化，進而提高植物抵抗外界環境壓力的能力。

2.1.1miR160/miR167與轉錄因子ARF互作研究

生長素可調節許多基因的表達，生長素響應因子（ARF）是調節其下游靶基因表達的基因。大多數ARF蛋白由3個特征結構域組成，即B3 DNA結合結構域（DBD），位于N末端區域;C-末端二聚化結構域（CTD），位于C-末端區域，是一個蛋白質-蛋白質相互作用結構域，其氨基酸序列與Aux/IAA蛋白質C-末端的結構域Ⅲ和Ⅳ相關，允許ARF或ARF和Aux/IAA蛋白的二聚化;賦予活化劑或阻遏物活性的可變中間區域（MR）。miR160和miR164被發現靶向ARF轉錄因子[9-10]。

在幾種植物物種中觀察到干旱和鹽脅迫條件下，miR393、miR160和miR167的表達上調，已有研究證明，鹽度觸發miR393表達，導致TIR1和AFB2受體的結合被抑制，進而影響生長素信號轉導途徑[11]。而miR160和miR164通過負調節生長素響應因子ARF10、ARF16、ARF17等在植物發育中起關鍵作用[12]。miR393/（miR160，miR167）與ARF轉錄因子之間存在一個應對脅迫的調控途徑，如圖1所示。生長素受體TIR1通過釋放AUX/IAA與生長素響應因子形成異二聚體的方式調控植物生長和發育所必需的生長素響應基因的表達。當生長素水平低時，ARF與AUX/IAA因子異二聚化。在結合生長素時，TIR1和AFB等受體被激活并使AUX/IAA成員泛素化，使原本因與AUX/IAA結合而被抑制的ARF得到釋放。這幾種保守的miRNA在生長素感知和信號傳導中起重要作用，miR393下調TIR1和AFB轉錄物的含量，miR160和miR167通過指導mRNA的切割來下調5種不同的ARF轉錄物的含量。在適宜的生長條件下，低水平的miR393以及miR160和miR167即可微調轉錄生長素響應基因所需的ARF水平。在應激期間，miR393的上調表達將TIR1保持在較低的水平，有助于抑制生長素信號傳導，從而增加AUX/IAA-ARF異二聚化。此外，miR160和miR167的表達量在應激期間也被上調，它們的上調引起ARF的下調，從而下調ARF介導的基因表達?？偟膩碚f，ARF介導的基因表達受到miR393、miR160和miR167的抑制，導致植物生長和脅迫下的發育減弱，促進植物對脅迫的耐受性。

2.1.2miR159與轉錄因子MYB互作研究

MYB轉錄因子廣泛分布于真核生物中，是植物界最大的轉錄因子家族之一。MYB蛋白具有高度保守的MYB結構域，其由在N末端的1～4個不完整的串聯重復組成。每個MYB重復序列編碼3個α-螺旋，其中第2個和第3個螺旋形成螺旋-轉角-螺旋結構，識別并結合特定識別位點C/TAACG/TG處的DNA主溝。前人研究證明，MYB轉錄因子被miR159、miR828和miR858等miRNA靶向，其主要調節植物在各種脅迫條件下的信號轉導和發育[14]。Gupta等研究表明，在不同脅迫條件下miR159的表達量有不同的表現，例如在20%聚乙二醇6000滲透脅迫下miR159表達量被顯著上調，在鹽脅迫和冷脅迫下miR159表達量呈現下調趨勢[15]，miR159可以通過控制ABI3的表達來調控MYB33轉錄因子的含量，從而參與ABA信號通路響應干旱[16]。

2.1.3miR156與轉錄因子SPL互作研究

SPL（SQUAMOSA promoter-binding protein-like）是植物特有的一類轉錄因子，廣泛存在于植物中。最初從金魚草（Antirrhinum majus）中篩選到2個SPL基因，分別命名為SBP1和SBP2，其因能夠識別并結合到SQUAMOSA的啟動子上而得名。SPL轉錄因子是植物發育時間的主要調節因子，由miR156在轉錄后調節。最近在擬南芥中的一項研究中發現，miR156介導的SPL2和SPL11表達量的下調增強了植物對環境脅迫的反應，包括植物的耐熱性[17]。研究發現，通過miR156過表達和SPL13 RNA含量降低能夠使紫花苜蓿顯示出對熱應激耐受性的增加，在熱應激下表現為水勢升高，非酶抗氧化劑含量、花青素含量和葉綠素豐度增加[18]。miRNA156同時被發現對植物耐鹽機制也有作用，在鹽處理條件下，miR156過表達基因型中苜蓿中記錄到總氮含量的增加和離子穩態的改變;在嚴重的鹽度脅迫下，miR156下調SPL轉錄因子家族基因的表達量，間接調控其他重要轉錄因子以及下游鹽脅迫應答基因的表達[19]。另有研究表明，miR156通過沉默SPL13減少水分損失和增加氣孔導度、增加葉綠素含量和增強光合同化作用，從而達到抗旱的作用[20]。

2.1.4miR164與轉錄因子NAC互作研究

作為植物中最大的轉錄因子家族之一，NAC包含復雜的植物特異性超家族，并且存在于多種物種中。NAC的首字母縮寫詞源自3種最早發現NAC結構域的蛋白質，分別為矮牽牛NAM、擬南芥ATAF1/2和CUC2。NAC被證明在植物應激反應期間在復雜的信號傳導網絡中發揮重要作用，尤其是在非生物脅迫下，NAC在植物中的表達會發生明顯變化[21]。NAC轉錄因子被miRNA廣泛靶向。幾項關于擬南芥和水稻的研究已經顯示，miR164通過切割NAC mRNA調節植物發育過程，并且能夠響應非生物脅迫[22-24]。在水稻中測試了6個miR164靶向NAC基因（OMTN1～OMTN6），結果發現，其中4個參與耐旱性的調控[22]。在胡楊中也發現，miR164指導PeNAC070、PeNAC012和PeNAC028 mRNAs的切割，在干旱和鹽脅迫條件下，miR164及其靶基因NAC070在根、葉和莖中的表達情況不同，總體而言增加了植物的抗旱性和耐鹽性[25]。孫宗艷在對甜菜抗逆性的研究中發現，甜菜根中的miR164在鹽處理12 h時表達量下降劇烈，葉中的miR164表達量在處理12 h 時下降，在處理24 h時呈現上升趨勢，隨后又下降，在根和葉中的miR164表達量都分別與根和葉中的NAC21/22呈負相關關系[26]。

2.2通過靶向應激相關結構基因抗逆

2.2.1miR398與CSD基因互作研究

逆境會引起植物體內自由基的積累，超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的活性氧（ROS）清除酶，它催化超氧化物自由基向H2O2和O2轉化，該反應構成了對氧化應激的第1層細胞防御，植物已經進化出3種具有不同金屬配體的SOD，即鐵SOD（Fe-SOD）、錳SOD（Mn-SOD）和銅/鋅SOD（Cu/Zn-SOD，也稱為CSD），其中Cu/Zn-SOD是植物中的主要銅酶。擬南芥基因組編碼3種CSD同工酶：細胞質中的CSD1、葉綠體中的CSD2和過氧化物酶體中的CSD3。在擬南芥中，miR398具有4個靶基因，分別為CSD1、CSD2、CCS和COX5b-1。當植物暴露于高光、重金屬（Cu2+和Fe3+）或甲基紫精（MV）條件下時，miR398的表達量下調，引起CSD2表達量的上調[27]，進而在氧化應激下提高植物性能。在高溫脅迫下，miR398表達量呈現上調趨勢，在miR398的4個靶標中除了COX5b-1之外，其余3個靶標的表達量都呈現下降趨勢，通過定點誘變CSD1、CSD2、CCS而產生的3種miR398特性轉基因擬南芥與野生型相比，在37 ℃中對熱應激更加敏感，可積累更高水平的超氧化物自由基[28]。

2.2.2miR395與APS基因互作研究

硫元素參與許多生物功能，并且是多種次級代謝物的必需元素，包括硫脂、硫酸葡萄糖胺、谷胱甘肽和輔酶。缺硫環境會嚴重影響植物的生長，因此，硫營養對植物生長和發育至關重要。植物可從土壤中獲得無機硫酸鹽形式的硫，從大氣中獲得二氧化硫和硫化氫氣體形式的硫。硫酸鹽在同化過程首先由ATP硫酸化酶催化無機硫酸鹽和ATP形成腺苷5′-磷酸硫酸鹽和無機焦磷酸鹽。隨后，腺苷5′磷酸硫酸鹽被2種不同的硫酸鹽同化途徑利用。前人對擬南芥中的4種ATP硫酸化酶編碼基因（APS基因）進行定量分析，結果發現，miR395靶向APS基因，在硫酸鹽限制期間，3種APS基因在轉錄后水平受miR395調節，miR395過表達植物中的硫酸鹽濃度增加[29-30]。更有研究證明，硫酸鹽濃度與miR395的豐度呈正相關關系，即miR395水平升高導致硫酸鹽濃度增加，而miR395豐度的下調導致硫酸鹽濃度降低。相應地，miR395靶向的APS基因的過表達導致硫酸鹽濃度的下降[31]。有研究在鎘脅迫下鑒定了過表達miR395的轉基因油菜，結果表明，過表達miR395的植物表現出比野生型更低程度的鎘誘導氧化應激，相比之下，轉化體中的葉綠素、谷胱甘肽和非蛋白質硫醇含量高于野生型[32]。

3展望

非生物脅迫對植物生長發育影響很大[33]，植物進化出了一套復雜的調控機制來應對不良環境。非生物脅迫誘導miRNA的異常表達，miRNA位于調節植物對非生物脅迫反應的基因網絡中心，使得miRNA成為改良農作物遺傳性狀的重要新靶標，包括植物對環境脅迫的反應。前人研究已經確定，miRNA的調控是通過與靶基因完全或不完全結合的方式來完全降解靶基因或抑制靶基因的翻譯過程，進而起到對靶基因不同程度的抑制作用。前人鑒定了多種植物中的miRNA，并且研究了各個miRNA的靶基因以及在不同脅迫下miRNA和其靶基因的表達量變化，分析其在植物抗逆中的作用。但總的來說，對于miRNA的研究大多數還是以不同物種中miRNA的鑒定為主，對于其在整體逆境調控網絡中作用的研究較少，根據現有的研究可以總結出，植物中的miRNA既有靶向應激相關轉錄因子的，也有靶向應激相關結構基因的，最終使植物在生理生化上作出應對脅迫的改變。今后應當加強對調控網絡的研究，更深入地探討miRNA在抗逆調控網絡的功能，進而更好地指導農作物的改良，增加作物產量，優化作物質量。

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