羅非魚SIRT1基因的克隆及其表達規律分析

陳亨德 褚武英 李玉瓏 許友卿 丁兆坤 鐘藝文 王利香 安曉玲

摘要：為了解克隆羅非魚SIRT1基因，并分析其在不同組織器官中的表達量和饑餓前后白肌和肝中的表達量，以期為研究羅非魚基因功能和代謝調控機制提供參考。采用逆轉錄PCR（RT-PCR）技術由羅非魚肌肉組織克隆獲得羅非魚SIRT1基因，并用生物信息學方法構建系統進化樹，利用實時熒光定量PCR（QRT-PCR）技術對SIRT1在羅非魚體內表達進行研究。結果顯示，SIRT1基因開放閱讀框（ORF）為2 109 bp，共編碼702個氨基酸，具有保守的DUF、SIR2和TPP保守結構域。進化樹分析發現，羅非魚與伯氏樸麗魚和紅麗魚的SIRT1首先成簇，說明2個物種的親緣關系最接近。且SIRT1基因在所檢測的組織、器官中均有表達，其中白肌、腸道中表達量最高，且差異顯著（P<0.05）。與饑餓組0 d相比，饑餓組7 d的白肌SIRT1基因mRNA的表達無明顯變化，而肝表達量卻顯著增加（P<0.05）。提示羅非魚SIRT1基因可作為信號轉導調控機體糖代謝、脂肪代謝的候選基因之一。

關鍵詞：羅非魚;SIRT1基因;實時定量PCR;饑餓;系統進化樹

中圖分類號： S917.4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0103-04

收稿日期：2018-07-25

基金項目：國家自然科學基金面上項目（編號：31472256）;湖南省長沙市科技計劃重點項目（編號：ZD1601003）;湖南省長沙市科技計劃一般項目（編號：K1705044）。

作者簡介：陳亨德（1993—），男，福建泉州人，碩士，研究方向為水生動物營養、生理生化和分子生物學。E-mail：335776526@qq.com。

通信作者：丁兆坤，博士，教授，研究方向為環境生物學、水生動物營養、生理、生化和分子生物學。E-mail：zhaokun.ding@hotmail.com。

羅非魚是聯合國糧食及農業組織（FAO）向全世界推廣的優質養殖魚類品系，目前全球有近百個國家和地區進行羅非魚的規?；斯ゐB殖，羅非魚同時也是我國農業農村部主要推廣的重要淡水養殖品種，我國羅非魚養殖產量在世界上高居榜首。尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）是羅非魚類中的主要養殖品種，該魚的養殖性能極其優越，具有生長快、食性廣、抗病強、肉質鮮美、富含谷氨酸和甘氨酸等特點[1]，深受許多美食愛好者的喜愛。

沉默信息調節因子2同源蛋白1（silent mating type information regulation 2 homolog1，簡稱SIRT1）是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核甘酸（NAD+）的組蛋白去乙?；竅2]，于1999年從人類中發現[3]。SIRT1能夠廣泛表達于成熟組織，在胚胎早期和生殖細胞中含量也較高[4]。哺乳動物中Sirtuins家族共有7名成員（SIRT1～SIRT7）[3]，其中SIRT1與沉默信息調節因子2的同源性最高[5]，是Sirtuins家族中目前研究得最為廣泛的1名成員。SIRT1在機體內可通過對幾種控制代謝轉錄因子的去乙?；饔脕碚{節其活性，廣泛參與機體的糖代謝和脂肪代謝通路，還參與基因轉錄、細胞衰老的調節過程[6]。SIRT1還可抑制成脂肪分化因子PPARγ的轉錄因子活性，減少脂肪的合成與堆積[7]。同時能夠使FOXO1、STAT3等去乙?；龠M糖異生而抑制糖酵解[8-9]。SIRT1還可以通過環磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，簡稱CREB），調節糖脂代謝[10]。目前對SIRT1基因的研究主要還是集中在人類、小鼠、家畜與家禽（豬、羊、雞等）上，對魚類SIRT1基因的相關研究還鮮有報道。本研究探討羅非魚SIRT1 mRNA在不同組織器官中的規律性表達，目的是為今后羅非魚SIRT1基因的相關研究提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗用魚是新鮮健康的成年羅非魚，體質量約為（500±10） g，于2018年3月采自湖南省水產科學研究所。分別解剖正常組0 d和饑餓組7 d試驗魚，采集白肌、紅肌、肝、腦、脾、腎、腸道和心臟8個新鮮的組織器官，放入已滅菌的1.5 mL 離心管中，立即轉存于液氮罐中運回實驗室，移置于-80 ℃冰柜中保存，用于總RNA提取和基因克隆。所用各種試劑、消耗品和容器均用高壓滅菌鍋處理，解剖工具和研磨器具經160 ℃烘烤6 h，滅活RNA酶。

1.2試驗方法

1.2.1羅非魚SIRT1基因的克隆

用Trizol Reagent試劑盒，并根據Trizol Reagent試劑盒使用說明書從成年羅非魚各組織器官中分別提取總RNA。將提取的羅非魚不同組織器官的總RNA稀釋后測定其D260 nm/D280 nm和濃度（ng/μL），并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對提取的RNA進行檢測，檢測其純度和完整性。采用寶生物工程（大連）有限公司提供的cDNA合成試劑盒，并按試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA第1鏈。

1.2.2內參基因的選擇及引物設計

從GenBank中下載其他魚類的SIRT1基因全序列，用DNAStar比對進行保守性分析。并運用Primer 5.0軟件設計羅非魚內參基因和目的基因的引物序列（表1），送生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成，合成后再1次對所有引物進行驗證。

1.2.3羅非魚SIRT1基因片段的克隆與序列測定

以cDNA為模板進行RT-PCR克隆，將擴增的DNA片段經瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析其純度。然后采用Omega純化試劑盒割膠回收，用TaKaRa公司的pMD19-T載體試劑盒，并按說明書連接過夜，再將得到的連接產物轉化到感受態細胞中，取50 μL 轉化產物涂板，37 ℃正置1 h后倒置過夜培養，挑取白色單菌斑培養，菌液經過PCR擴增，電泳分析確定插入片段是否正確。對于篩選出的陽性菌，克隆提取質粒送上海博尚生物工程技術服務有限公司測序，測序結果經模板比對以及National Center for Biotechnology Information（NCBI）數據庫中Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）檢索，確定為目的基因片段后，使用DNAstar軟件進行序列拼接。

1.2.4實時熒光定量PCR

本試驗采用SYBR GreenⅠ染料法，在QRT-PCR儀（博樂公司CFX96TM型號）上進行擴增和數據分析。以最小的CT值和最高的熒光值為標準，分別對引物的濃度、循環的條件、退火溫度等試驗流程進行優化。擴增二步法反應程序如下：95 ℃ 30 s預變性;95 ℃ 5 s變性，58 ℃ 25 s退火、延伸，循環40次;繪制熔解曲線;65～95 ℃，每0.5 ℃讀板1次。

1.3數據統計與分析

實時熒光定量PCR后，根據收集到的目的基因與內參基因的CT值，運用2-ΔΔCT方法[11]計算出目的基因的相對表達量。運用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型（GLM）對SIRT1基因的相對表達量進行單因素方差分析，采用最小顯著差數法（LSD）進行多重比較，并用SigmaPlot 12.0軟件對處理完成的數據作羅非魚SIRT1基因的相對表達柱狀圖。所有結果以平均值±標準差（X±SD）表示。P<0.05為有顯著差異。

2結果與分析

2.1羅非魚SIRT1基因的生物信息學分析

SIRT1基因編碼區為2 109 bp（GenBank登錄號：MH229477），編碼702個氨基酸，推導的SIRT1蛋白相對分子量為76 571.30 u，等電點為4.64。用“http：//www.molbiol-tools.ca/Motifs.htm”網站上的在線軟件進行氨基酸結構域分析，可知SIRT1基因具有保守的DUF、SIR2和TPP結構域（圖1）。

2.2氨基酸序列比對和系統進化樹構建

從NCBI網站上收集到不同物種SIRT1基因的氨基酸序列（表2），然后利用Bio Edit和MEGA 7.0軟件分別進行氨基酸序列的比對及SIRT1基因的系統進化樹構建（圖2）。

圖2的進化樹分析表明，羅非魚SIRT1與伯氏樸麗魚和紅麗魚的SIRT1首先成簇，三者同源性高達98%，說明2個物種的親緣關系最為接近。魚類SIRT1與哺乳類、鳥類、昆蟲類及人的同源性存在一定的差異，其原因可能是所含的蛋白質種類和構型差異較大所致。由分析樹可以看出，即使同為魚類的孔雀魚和白斑狗魚，即低等魚類和高等魚類之間氨基酸肽鏈長度和空間構型仍有巨大的差別。

2.3不同組織中SIRT1 mRNA表達量分析

采用QRT-PCR檢測羅非魚的白肌、紅肌、肝、脾、腎、腸道、腦和心臟組織/器官中SIRT1基因mRNA的表達量，表達結果（圖3）顯示，SIRT1基因在白肌和腸道組織中的表達量最高，在腦組織中也有較高表達，但在肝、脾、腎等組織中的表達量相對較弱，表明SIRT1在羅非魚的不同組織器官中表達差異較大，具有較強的組織器官特異性。

2.4饑餓7 d羅非魚白肌和肝SIRT1基因mRNA表達量

在饑餓狀況下，肌肉和肝在機體能量調節中發揮十分重要的作用。經過7 d饑餓的羅非魚（饑餓組），與饑餓0 d的羅非魚相比較，饑餓組羅非魚的白肌和肝SIRT1 mRNA表達量均有增加，且在肝中的表達量顯著上升（P<0.05）（圖4），說明在饑餓環境中，羅非魚SIRT1基因與機體的脂肪代謝及能量代謝有密切關系。

3討論

本研究采用RT-PCR技術克隆得到羅非魚SIRT1基因的完整開放閱讀框（ORF）區序列為2 109 bp，具有保守的DUF、SIR2和TPP結構域，其蛋白相對分子量為76 571.30 u，等電點為4.64，共編碼702個氨基酸。本研究利用Bio Edit和MEGA 7.0軟件分別進行氨基酸序列的比對及構建SIRT1基因的系統進化樹模型，用作建樹的18個物種分屬于硬骨魚綱、昆蟲綱、鳥綱以及哺乳綱4大類群。構建的系統進化樹表明，羅非魚SIRT1與伯氏樸麗魚和紅麗魚的SIRT1首先成簇，表示2個物種間的親緣關系較近。魚類SIRT1與哺乳類、鳥類、昆蟲類以及人的同源存在一定的差異，其原因可能是所含的蛋白質種類和構型差異較大。即使同為魚類，如孔雀魚和白斑狗魚，低等魚類和高等魚類之間的氨基酸肽鏈長度和空間構型仍有一定的差距，推測SIRT1基因的氨基酸肽鏈長度和空間結構可能與肌肉發育和進化的程度有關。

羅非魚SIRT1基因mRNA表達量在所檢測的各組織器官中均有表達，在白肌和腸道組織中表達量最高，在腦組織也有較高的表達，說明羅非魚SIRT1基因的表達具有較強的組織特異性。研究發現，SIRT1定位于小鼠下丘腦的禁食區，能通過抑制脂肪細胞基因和FOXO1的表達，影響脂質代謝[12-15]。Bai等在對豬的研究中也發現，SIRT1基因的表達量與脂肪代謝存在密切的相關性[16-17]。潘洋洋等在SIRT1基因對綿羊不同組織器官影響的差異性研究中發現，綿羊SIRT1基因在肌肉組織中具有較高表達[18]。羅非魚SIRT1基因在白肌組織和腸道組織中的表達量最高的原因可能是SIRT1基因廣泛參與羅非魚的能量代謝的調節作用，但目前還沒有相關研究能夠證實這一點，需要進一步分析研究。

肝臟作為主要糖脂代謝器官，能夠影響機體營養物質分解吸收和激素信號的傳遞，在機體中發揮著巨大作用。研究發現，在短期禁食條件下，SIRT1可以抑制糖異生關鍵因子TORC2，影響血糖濃度。而在長期禁食條件下，SIRT1去乙?；⒓せ頟GC1-α和PPARα，促進脂肪酸的氧化并改善葡萄糖的穩態[19]。在對人體肝細胞的研究中發現，生理條件下PGC-1α上賴氨酸殘基會在SIRT1的作用下發生去乙?；?，將PGC-1α激活，從而有效抑制糖酵解，促進了肝葡萄糖的輸出[20-21]。PPARγ通過促進成纖維細胞向脂肪細胞分化和脂肪酸合成可加快脂肪沉積，而PPAR-γ在SIRT1基因過表達的情況下發生轉錄抑制，抑制脂肪生成，促進游離脂肪酸釋放及脂解作用的增加[7]。此外，SIRT1還能對膽固醇等進行乙酰化并活化，從而對肝中的膽固醇通量進行有效調節[22]，進一步證實了SIRT1基因表達與脂肪代謝存在相關性。本研究饑餓條件下也發現，羅非魚SIRT1基因在肝中表達量顯著增加（P<0.05），可見SIRT1基因與機體的糖代謝和脂肪代謝聯系十分密切。因此推測SIRT1基因可作為信號轉導調控機體糖代謝、脂肪代謝的候選基因之一，能夠通過多種通路途徑直接或間接調節羅非魚的脂質代謝。

4結論

羅非魚的白肌、紅肌、肝、腦、脾、腎、腸道和心臟組織器官中SIRT1基因mRNA表達量的結果顯示出一定的規律性，且在白肌和腸道組織中表達量最高，推測SIRT1基因可能通過不同的信號通路，參與羅非魚能量代謝的調節。而且在饑餓處理下SIRT1基因mRNA的表達量在白肌中有所增加，在肝中顯著增加（P<0.05），表明羅非魚SIRT1基因可能與脂肪代謝活動密切相關，能夠通過多種通路途徑直接或間接調節羅非魚的能量代謝。

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