金艷獼猴桃組織培養適宜條件篩選

吳燕燕 章辰飛 吳志勇 吳月燕

摘要：以金艷獼猴桃嫩葉、莖段作為外植體材料，研究不同消毒體系滅菌效果及不同激素組合對愈傷組織、不定芽、生根等誘導的影響。結果表明，葉片消毒相對最優方法為70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 3 min，莖段消毒相對最優方法為70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 4 min;莖段比葉片更容易染菌，而葉片比莖段更容易褐化;愈傷組織誘導時，葉片最優激素組合為6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，莖段為6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L;不定芽誘導最優激素組合為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，在此條件下不定芽長勢較快，含單芽或多芽，有少量愈傷組織;最適生根培養基為1/2MS+IBA 0.8 mg/L，生根率達到87.78%，植株生長健壯，根密、多。

關鍵詞：金艷;獼猴桃;組織培養;激素;愈傷組織;嫩葉;莖段

中圖分類號： S663.404+.3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0111-04

收稿日期：2018-08-22

基金項目：浙江省一流學科（A）生物工程創新（編號：CX2017013）。

作者簡介：吳燕燕（1993—），女，浙江杭州人，碩士，從事植物生理生化研究。E-mail：935986197@qq.com。

通信作者：吳月燕，碩士，從事遺傳育種研究。E-mail：wyynb2009@163.com。

在獼猴桃快繁技術體系建立中，通常是以葉片、葉柄、莖尖、莖段、種子等作為外植體進行研究的[1-6]，而不同外植體材料對愈傷組織、不定芽的誘導能力有很大差別，如甘麗萍等研究指出，嫩莖是誘導愈傷組織最好的外植體[7]。對同一種外植體而言，不同放置方式也會影響快繁效果，有研究表明，葉片上表面朝下的愈傷組織誘導率較高，莖段橫放比豎放誘導效果好[8]。同時，在組織培養過程中，不同生長調節劑（激素）會發揮不同的作用，生長素、細胞分裂素在組織培養中對組織生長起著非常關鍵的作用。另外，碳源種類、濃度等也會影響組織培養快繁效果，有研究表明，低濃度碳源不能很好誘導芽的分化形成，而過高濃度碳源雖可促進芽分化，但抑制苗的生長[9]。

金艷是中國科學院武漢植物園以“毛花”獼猴桃為母本，“中華”獼猴桃為父本雜交培育出的獼猴桃新品種[10]，具有豐產、穩產、可溶性固形物含量高、果實極耐貯藏、糖酸比高等優良特性[10-11]，目前鮮見對金艷獼猴桃組織培養快繁的研究報道。本試驗以金艷獼猴桃莖段、葉片為外植體，設計不同激素濃度及配比，以篩選出適宜金艷獼猴桃組織培養快繁的條件，為金艷獼猴桃的快速推廣應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料選擇

2017年4—5月，于浙江省寧波市北侖區北侖芳野瓜果有限公司獼猴桃基地采取金艷獼猴桃帶有嫩葉的新梢莖段，冰箱中4 ℃冷藏。

1.2不同消毒劑及消毒時間對金艷獼猴桃外植體的滅菌效果

將采集的金艷獼猴桃帶葉莖段，去爛葉爛頭，用洗潔精清洗1次，再用流水沖洗30 min;分別取3～6 cm的莖段、5～30 cm2 的嫩葉，分別以70%乙醇、0.1%氯化汞（HgCl2）處理不同時間進行滅菌消毒;無菌水清洗4～5次，濾干，用無菌紙吸干莖段或嫩葉表面水分;切取莖段長約1 cm、葉片約0.5 cm2，并接種到培養基上，定期觀察外植體污染、褐化數量及生長情況，統計污染率、褐化率，計算消毒效果[7]。

1.3不同激素組合對愈傷組織、不定芽、生根的誘導情況

1.3.1愈傷組織誘導無菌環境條件下，將經預處理的葉片及莖段分別接種到以MS為基礎培養基，分別添加有6-芐氨基嘌呤（6-BA）0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L和萘乙酸（NAA）0.1、0.5 mg/L為組合激素的培養基上，共設置10個處理;接種后20 d調查各處理愈傷組織誘導情況，統計誘導率。

1.3.2不定芽誘導無菌環境條件下，將愈傷組織轉接到以MS為基礎培養基，分別添加有6-BA 0.5、1.0、1.5 mg/L和NAA 0.1、0.3、0.5 mg/L為組合激素的培養基上，共設置9個處理;接種后20 d調查各處理愈傷組織不定芽誘導情況。

1.3.3生根誘導無菌環境條件下，將誘導形成帶有4～5張葉片的不定芽轉接到以1/2MS培養基為基礎培養基，分別添加吲哚丁酸（IBA）0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/L的生根培養基上進行生根培養，接種后30 d調查統計生根情況。

1.4培養條件

誘導培養基中須同時添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH值調控到在5.7～5.8之間。培養室內培養溫度為23～26 ℃，光照度為1 000～1 500 lx，光照時間為16 h/d。

1.5統計分析

采用Excel 2010軟件對試驗數據進行統計分析。

2結果與分析

2.1不同消毒劑及消毒時間對金艷獼猴桃外植體的滅菌效果

消毒不僅是將外植體表面的微生物去除，同時也是對外植體自生菌的消減，會對外植體本身造成一定影響，而消毒劑種類和消毒時間的不同會影響其對外植體的消毒效果。由表1可知，葉片消毒效果相對最好的方法為70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 3 min，此時污染率為12.50%，褐化率為12.50%，消毒效果達到87.50%，莖段消毒效果相對最好的方法為70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 4 min，此時污染率為7.50%，褐化率為10.00%，消毒效果達到91.25%;同種消毒劑消毒不同時間，對金艷獼猴桃外植體的效果差異較大，消毒劑為70%乙醇時，不同消毒時間葉片污染率高低為10 s>20 s>30 s，莖段為10 s>20 s=30 s，消毒劑為0.1% HgCl2時，不同消毒時間葉片污染率高低依次為3 min>4 min>5 min，莖段為3 min>4 min=5 min，說明消毒時間越長，外植體滅菌效果相對越好;同一消毒劑消毒相同時間，莖段污染率多高于葉片，說明莖段比葉片更容易染菌，這可能是由于莖段采集時會產生傷口，進而導致莖段更易遭受外生菌和內生菌侵染;消毒劑為70%乙醇時，不同消毒時間葉片褐化率高低依次為20 s=30 s>10 s，莖段為30 s>20 s>10 s，消毒劑為0.1% HgCl2時，不同消毒時間葉片、莖段褐化率高低均依次為5 min>4 min>3 min，說明消毒時間越長，消毒劑對葉片、莖段傷害越大，并主要表現在外植體的切面上;同一消毒劑消毒相同時間，葉片的褐化率多高于莖段，其褐化程度相對更為嚴重，這一方面可能是由于切取葉片時受到的機械傷害大于莖段，另一方面可能是消毒劑對葉片的毒害作用高于莖段。

2.2不同激素組合對愈傷組織、不定芽、生根誘導的影響

2.2.1對愈傷組織誘導的影響葉片、莖段誘導形成的愈傷組織分別見圖1、圖2，影響結果見表2。由表2可知，誘導產生葉片愈傷組織的相對最適激素組合為6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，其誘導率為90.0%，而激素組合6-BA1.5 mg/L+NAA0.5 mg/L 的誘導率相對最低，僅為48.5%;誘導產生莖段愈傷組織的相對最適激素組合為6-BA0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L，其誘導率為97.5%，而激素組合6-BA1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的誘導率相對最低，僅為43.0%;NAA質量濃度一定時，隨6-BA質量濃度的增加，葉

片愈傷組織誘導率總體呈先增后降趨勢，說明適度低質量濃度6-BA有利于葉片愈傷組織的產生，而高質量濃度6-BA不利于葉片愈傷組織的產生;對莖段而言，NAA質量濃度為0.1 mg/L時，隨6-BA質量濃度的增加，莖段愈傷組織誘導率呈逐漸下降趨勢，而在NAA質量濃度為0.5 mg/L 時，莖段愈傷組織誘導率呈先下降后上升趨勢，NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L更不利于莖段誘導產生愈傷組織。

2.2.2對不定芽誘導的影響由表3可知，激素組合6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L時，不定芽分化率相對最高，達到65.00%，不定芽長勢較快，含有單芽或多芽，有少量愈傷組織產生; 當NAA質量濃度為0.1 mg/L時，隨6-BA質量濃度的增加?愈傷組織不定芽分化率呈先增后降趨勢?當NAA質量濃度分別為0.3、0.5 mg/L時，隨6-BA質量濃度的增加，愈傷組織不定芽分化率呈增加趨勢，說明高質量濃度6-BA有利于不定芽的分化，而NAA為0.1 mg/L時出現的下降可能是由于6-BA與NAA用量比值過高，抑制了不定芽的產生;6-BA質量濃度一定時，隨NAA質量濃度的增加，不定芽分化率呈逐漸下降趨勢，高質量濃度NAA抑制愈傷組織分化成不定芽，還對不定芽的生長產生抑制作用。

2.2.3對生根培養的影響圖3為不定芽誘導形成的苗，圖4為生根的無菌苗，對生根培養的影響結果見表4，由表4可知?隨IBA濃度的增加?不定芽生根率呈先升后降趨勢，IBA質量濃度為0.8 mg/L時生根率相對最高，達到87.78%，此時植株生長健壯，根密、多;IBA質量濃度分別為0.5、0.9 mg/L 時，不定芽生根率都低于25.0%，說明IBA質量濃度過低或過高都不利于根的生長。

3結論與討論

外植體滅菌是植物組織培養中至關重要且必不可少的環節，而消毒劑的選擇與使用十分關鍵。消毒劑種類很多，找到適宜的消毒劑和消毒時間對組織培養可起到事半功倍的作用。于紅梅等研究認為，0.1% HgCl2作為消毒劑，其消毒效果明顯好于NaClO、H2O2[7]。 本試驗結果表明??葉片最適消毒組合為70%乙醇30 s+0.1% HgCl2 3 min，消毒效果達到87.50%;莖段消毒最適組合為70%乙醇30 s+0.1% HgCl24 min，消毒效果達到91.25%;莖段比葉片更容易染菌，這可能是由于莖段采集時會產生傷口，進而導致莖段更易遭受外生菌和內生菌侵染;葉片比莖段更容易褐化，這可能是由于切取葉片時受到的機械傷害大于莖段?或是消毒劑對葉片的毒害作用高于莖段。

生長素是植物愈傷組織誘導中必須使用的物質[12-13]。杜希華等研究指出，培養基中只添加6-BA是無法誘導出愈傷組織的，生長素和細胞分裂素的配合使用有利于愈傷組織的誘導[14]。本試驗結果表明，在一定質量濃度范圍內，低質量濃度6-BA有利于葉片愈傷組織的產生，而高質量濃度6-BA 不利于葉片愈傷組織的產生;NAA質量濃度為0.1 mg/L 時，隨6-BA質量濃度的增加，莖段愈傷組織誘導率呈逐漸下降趨勢，而在NAA質量濃度為0.5 mg/L時，莖段愈傷組織誘導率呈先下降后上升趨勢，NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L更不利于莖段誘導產生愈傷組織，這與吳興海的研究結果[15]較為吻合。

細胞分裂素對獼猴桃愈傷組織分化和芽分化誘導起關鍵作用[16]。朱寶成等認為，NAA除能誘導愈傷組織分化外，還能跟6-BA配合使愈傷組織分化出芽和根[17]。楊成行等研究表明，金線蓮再生培養體系中，細胞分裂素和生長素配合使用能促進叢生芽的誘導[18]。本試驗結果表明，6-BA質量濃度一定時，隨NAA質量濃度的增加，不定芽分化率呈逐漸下降趨勢，高質量濃度NAA抑制愈傷組織分化成不定芽，還對不定芽的生長產生抑制作用，這可能是由于NAA作為生長素誘導形成愈傷組織的效果要明顯優于不定芽，同時也符合生長素與細胞分裂素比值越小則越有利于芽分化，而比值越大則有利于根分化的試驗規律;NAA質量濃度為0.1 mg/L時，隨6-BA質量濃度的增加，愈傷組織不定芽分化率呈先增后降趨勢，這種下降的出現可能與6-BA、NAA比值過高而存在毒副作用，從而抑制不定芽的產生[15]有關。

吳興海研究指出，使用IBA 0.6 mg/L誘導獼猴桃生根時會產生少量愈傷組織，生根率低，且芽的生長受到抑制[15]。隆前進認為，高質量濃度IBA處理獼猴桃扦插苗可能會有毒害作用而降低其生根率[19]。本試驗結果表明，金艷獼猴桃最適生根的IBA質量濃度為0.8 mg/L，其生根誘導率相對最高，達87.78%，而不論是低質量濃度IBA還是更高質量濃度IBA都不利于根的生長;IBA質量濃度為0.9 mg/L時獼猴桃生根率出現驟降，可能與高質量濃度IBA對不定芽產生毒害作用有關。

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