杜梨響應鹽脅迫CIPK01的克隆及表達分析

王影 李慧 藺經 楊青松 常有宏

摘要：CBL互作蛋白激酶（CIPK，CBL-interacting protein kinases）是與鈣調磷酸酶B類蛋白（CBL，calcineurin B-like protein）特異結合的蛋白激酶，廣泛參與植物的生長發育以及生物和非生物脅迫響應?？寺『丸b定杜梨響應鹽脅迫的CIPK基因，對杜梨抗逆分子機制和抗逆性研究具有重要意義。選取了一個特殊的基因PbCIPK01做進一步的研究，通過生物信息學和實時熒光定量PCR技術分析該基因的序列特征以及在鹽脅迫下的表達模式。該基因全長為1 368 bp，含有1 365 bp的開放閱讀框，編碼455個氨基酸，DNA序列為5 051 bp，包含12個外顯子和11個內含子。實時熒光定量PCR分析結果表明，該基因在杜梨的葉片中表達量最高，且受鹽脅迫誘導下調表達。

關鍵詞：杜梨;鹽脅迫;CIPK基因;序列分析;基因表達;抗逆基因;抗逆機制

中圖分類號： S661.201文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0115-05

收稿日期：2018-08-03

基金項目：國家自然科學基金（編號：31372051、31772287）;江蘇省自然科學基金（編號：BK20151361）。

作者簡介：王影（1993—），女，安徽宿州人，碩士研究生，主要從事果樹種質資源與分子育種研究。E-mail：1759068060@qq.com。

通信作者：常有宏，研究員，博士生導師，主要從事果樹種質資源和栽培技術等研究。E-mail：cyh@jaas.ac.cn。

Ca2+是植物中普遍存在的第二信使，與Ca2+傳感器結合進行信號傳遞，在植物抗低溫、抗旱、抗鹽等脅迫中發揮重要作用。鈣調磷酸酶B類蛋白（CBLs，calcineurin B-like proteins）作為植物體內特異的Ca2+傳感器必須與下游的靶蛋白CBL互作蛋白激酶（CIPK，CBL-interacting protein kinases）相互結合才能共同發揮作用[1]。CIPK是植物特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該蛋白在植物響應逆境脅迫中發揮重要作用，尤其與非生物脅迫（高鹽、ABA、干旱等）的信號傳導密切相關[2]。在模式植物擬南芥中，所有的CIPK蛋白含有C-端的調節域和N-端的激酶蛋白域，CIPK蛋白C-端的調節區有2個明顯功能域，是NAF結構域和PPI結構域，NAF結構域能與CBL特異結合[3]，PPI結構域[4]是CIPK與蛋白磷酸酶的作用位點，這2個結構域的特性使得CIPK成為一個連接CBL傳導信號途徑的重要分子開關，使其能更好地發揮信號調控作用[5]。

截至目前，已有越來越多的CIPK基因被克隆，在模式植物擬南芥中發現有25個[6]，玉米中有43個[7]，葡萄[8]和油菜[9]中分別有23個。關于CIPK基因的研究目前主要集中在擬南芥[6]、玉米[7]、水稻[10]和甘蔗[11]上，水稻OsCIPKs基因受不同程度的生物脅迫和非生物脅迫誘導表達;甘蔗ScCIPKs基因在應對非生物脅迫逆境中協同發揮作用，同時在生物脅迫（接種花葉病毒）下表現出差異表達水平。由此推測，杜梨CIPK基因可能也受非生物脅迫的誘導表達。

杜梨作為中國梨樹栽培中普遍應用的一種砧木，具備耐澇、抗寒、耐鹽堿、抗旱等綜合抗性，是梨屬植物中重要的抗性種質資源[12]。本研究首先采用同源克隆技術從杜梨中克隆CIPK基因，然后利用實時定量PCR技術分析該基因在鹽脅迫下不同組織和不同時間（0、12、24、48、72 h）的表達模式，以期為杜梨抗逆基因的發掘和抗逆機制的解析提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料與脅迫處理

單株來源的杜梨組培苗保存于江蘇省農業科學院果樹研究所仁果研究室。經分生根培養30 d后，選擇生長一致的植株，移栽到溫室營養土穴盤中繼續培養，待幼苗長至10 cm左右，選取生長良好、發育一致的杜梨苗流水沖洗干凈，用紙浸干，然后分別置于去離子水和NaCl溶液中處理，于0、12、24、48、72 h分別取根、莖和葉片，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2總RNA的提取及cDNA的合成

采用RNA Simple Total RNA Kit[天根生化科技（北京）有限公司]提取杜梨總RNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，采用PrimeScript RT-PCR Kit試劑盒（TaKaRa）合成第一鏈cDNA。

1.3杜梨CIPK基因的cDNA和基因組DNA全長序列的克隆

以中國白梨（Pyrus×bretschneideri）基因組數據庫中的CBL-interacting serine/threonine- protein kinases 5這個基因（XM_018648989.1）作為電子探針，搜索杜梨鹽脅迫轉錄組數據庫[13]，獲得候選基因，設計特異引物（P1：5′-ATGGTGATCGTGAGAAAAG-3′，P2：5′-ACTAGTCAGCAACTCTTGG-3′），以未處理和經過NaCl處理的杜梨葉片的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為：cDNA 1.0 μL，引物各1.0 μL，10× PCR Buffer 2.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）3.2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，LA Taq（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 9.6 μL。反應條件為：95 ℃ 4 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環;72 ℃ 10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收;同時，提取杜梨植株總DNA（TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit，TaKaRa）和設計引物（P1′：5′-AAATACAAGACTCCTCCAATTA-3′，P2′：5′-TTTTTCTTGCATTCTGAATCATA-3′），以杜梨總DNA為模板擴增該基因的基因組序列。分別連接pMD18-T載體并轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒經菌液PCR鑒定后測序。引物合成和測序都委托上海皓嘉生物技術有限公司完成。

[2]黃瓏，蘇煒華，張玉葉，等. 甘蔗CIPK基因的同源克隆與表達[J]. 作物學報，2015，41（3）：499-506.

[3]Albrecht V，Ritz O，Linder S，et al. The NAF do-main defines a novel protein-protein interaction module in Ca2+-regulated kinases[J]. EMBO Journal，2001，20：1051-1063.

[4]Lee S C，Lan W Z，Kim B G，et al. A protein phosphoryla-tion /dephosphorylation network regulates a plant potassium channe[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104：15959-15964.

[5]Sanchez-Barrena M J，Fujii H，Angulo I A，et al. The structure of the C-terminal domain of the protein kinase AtSOS2 bound to the calcium sensor AtSOS3[J]. Molecular Cell，2007，26（3）：427-435.

[6]Yu Y H，Xia X L，Yin W L，et al. Comparative genomic analysis of CIPK gene family in Arabidopsis and Populus[J]. Plant Growth Regulation，2007，52（2）：101-110.

[7]Zhao J，Sun Z，Zheng J，et al. Cloning and characterization of a novel CBL-interacting protein kinase from maize[J]. Plant Molecular Biology，2009，69（6）：661-674.

[8]Diane M M，Sebastien A，Marina B S，et al. Functional annotation，genome organization and phylogeny of the grapevine（Vitis vinifera）terpene synthase gene family based on genome assembly，FLc DNA cloning and enzyme assays[J]. BMC Plant Biology，2010，10：226.

[9]張翰風. 油菜與擬南芥中鈣相關蛋白激酶基因調控非生物逆境響應的機制研究[D]. 楊凌：西北農林科技大學，2014：56-89.

[10]陳析豐，顧志敏，劉峰，等. 生物與非生物脅迫下水稻CIPK基因的鑒定分析[J]. 中國水稻科學，2010，24（6）：567-574.

[11]黃瓏. 甘蔗ScCBLs和ScCIPKs基因家族的克隆與鑒定[D]. 福州：福建農林大學，2016：53-65.

[12]李慧，叢郁，常有宏，等. 杜梨CPI基因的克隆、序列分析及表達[J]. 江蘇農業學報，2011，27（5）：1070-1077.

[13]Li H，Lin J，Yang Q S，et al. Comprehensive analysis of differentially expressed genes under salt stress in pear （Pyrus betulaefolia） using RNA-Seq[J]. Plant Growth Regulation，2017，82（3）：409-420.

[14]Xu Y Y，Li H，Li X G，et al. Systematic selection and validation of appropriate reference genes for gene expression studies by quantitative real-time PCR in pear[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2015，37（2）：40-48.

[15]Chung E，Park J M，Oh S K，et al. Molecular and biochemical characterization of the capsicum annuum calcium-dependent protein kinase 3（Ca CDPK3）gene induced by abiotic and biotic stresses[J]. Planta，2014，220（2）：286-295.

[16]沈金秋，鄭仲仲，潘偉槐，等. 植物CBL-CIPK信號系統的功能及其作用機理[J]. 植物生理學報，2014，50（5）：641-650.

[17]Mahajan S，Tuteja N.Cold，salinity and drought stresses：anoverview[J]. Arch，Biochem，Biophys，2005，444：139-158.

[18]李紅，李波，楊瞾. 鹽脅迫下外源鈣對苜蓿幼苗葉片離子含量的影響[J]. 江蘇農業科學，2017，45（4）：131-133.

[19]董靜，邢錦城，王茂文，等. 3種外源物質浸種對NaCl脅迫下馬齒莧種子萌發的影響[J]. 江蘇農業科學，2017，45（14）：103-106.

[20]Luan S，Kudla J，Rodriguez-Concepcion M，et al.Calmodu-lins and calcineurin B-like proteins：calcium sensors for specifcsignal response coupling in plants[J]. Plant Cell，2002，14（Suppl）：389-400.

[21]Roy S J，Huang W，Wang X J，et al. A novel protein kinase involved in Na plus exclusion revealed from positional cloning[J]. Plant Cell and Environment，2013，36（3）：553-568.

[22]Deng X M，Hu W，Wei S Y，et al. TaCIPK29，a CBL-Interacting protein kinase gene from wheat，confers salt stress tolerance in transgenic tobacco[J]. PLoS One，2013，8（7）：69-81.

[23]Li R F，Zhang J W，Wu G Y，et al. HbCIPK2，a novel CBL-interacting protein kinase from halophyte Hordeum brevisubulatum，confers salt and osmotic stress tolerance[J]. Plant Cell and Environment，2012，35（9）：1582-1600.

[24]Tripathi V，Parasuraman B，Laxmi A，et al. CIPK6，a CBL-interacting protein kinase is required for development and salt tolerance in plants[J]. Plant Journal，2009，58（5）：778-790.

[25]Wang R K，Li L L，Cao Z H，et al. Molecular cloning and functional characterization of a novel apple MdCIPK6L gene reveals its involvement in multiple abiotic stress tolerance in transgenic plants[J]. Plant Molecular Biology，2012，79（1/2）：123-135.