小花寬葉十萬錯石油醚萃取相GC-MS分析及其化感作用研究

李曉霞 沈奕德 劉延 王亞 陳頌梅 張敏 范志偉

摘要：以海南省近年來突發的外來入侵植物小花寬葉十萬錯[Asystasia gangetica subsp. micrantha （Nees） Ensermu]為研究對象，采用氣象色譜-質譜聯用（GC-MS）技術對小花寬葉十萬錯地上部分石油醚萃取相進行化學成分分析，并采用不同質量濃度（0.012 5、0.025、0.05 g/mL）的小花寬葉十萬錯地上部分石油醚萃取相對三葉鬼針草（Bidens pilosa var. radiate Sch. Bip.）和假臭草[Praxelis clematidea （Griseb.） R. M. King et H. Rob.]進行培養皿濾紙法的化感作用測定。結果表明，小花寬葉十萬錯石油醚萃取相共鑒定出29種化合物，占總量的97.917%，以醇類為主，占總量的51.384%，其次為脂類（18.372%），再次為烯烴類（16.264%），此外還有酚、醛、酸等。生物測定結果表明，小花寬葉十萬錯石油醚萃取相對伴生種三葉鬼針草和假臭草的種子萌發、幼苗生長均產生化感抑制作用，其中普遍發現對根長的抑制作用強于對莖長的抑制作用。以上結果說明，小花寬葉十萬錯通過釋放化感物質，可起到抑制鄰近植物生長的作用，提高其入侵力。

關鍵詞：小花寬葉十萬錯;地上部分石油醚萃取相;GC-MS;化感作用

中圖分類號： R284.1;Q949.778.6文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0168-04

收稿日期：2018-08-13

基金項目：中央級公益性科研院所基本科研業務費（編號：2018hzs1J005、2016hzs1J019）。

作者簡介：李曉霞（1983—），女，云南大理人，助理研究員，主要從事熱帶農林雜草生物學、生態學與綜合監控技術研究。E-mail：lixiaoxiayn@163.com。

通信作者：范志偉，博士，研究員，主要從事入侵植物與雜草生物學、生態學與綜合監控技術研究。E-mail：fanweed@163.com。

外來入侵植物嚴重威脅本地生態系統，生物多樣性平衡已成為世界各國的生態問題，甚至給社會經濟和自然環境造成了巨大的沖擊[1]。關于外來入侵植物的成災機制一直是農業生態學關注的問題。目前，在多種入侵植物的研究中已發現化感作用的入侵機制?；凶饔檬侵参镌谏L過程中，通過淋溶、根系分泌、揮發、植物殘體分解4種途徑向環境中釋放化感物質并對其他植物或微生物產生直接或間接的有利或有害的作用[2]。隨著對入侵植物的研究的深入，發現多數入侵植物通過分泌化感物質，提高自身適應環境、生存與競爭的能力，從而形成單優勢入侵種群，因此，認為化感作用是入侵植物的一種“新型”化學武器[3-6]。研究證實，許多入侵植物在其入侵新生境的過程中通過釋放化學物質抑制植物的種子萌發和生長，如薇甘菊[7]、紫莖澤蘭[8-9]、飛機草[10]、香茅[11]等。因此，開展植物化感作用研究對于入侵植物替代控制[12]、農田雜草防除[11]、開發植物源除草劑[13]等具有重要意義。

小花寬葉十萬錯[Asystasia gangetica subsp. micrantha （Nees） Ensermu]是爵床科十萬錯屬多年生草本植物，原產于非洲、印度和斯里蘭卡，現已成為中國臺灣、馬來西亞、澳大利亞、印度尼西亞、太平洋島嶼等地區的重要入侵物種[14-16]。小花寬葉十萬錯最早于2005年在海南儋州被發現，據筆者所在研究團隊多年的觀測發現，該植物已迅速演變成為海南西北部地區的重要外來入侵植物，已經對入侵區域的農牧業、林業生產與管理帶來了嚴重的影響。因此，關于小花寬葉十萬錯如何入侵及如何迅速占據強大生境等的研究已經成為當下重要的課題。從其強大的競爭力和生長特性來看，很有可能含有抑制其他植物生長的化感物質。然而，目前關于小花寬葉十萬錯化感作用的研究未見報道。為驗證這一推測，本研究通過乙醇提取、石油醚萃取小花寬葉十萬錯地上部分脂溶性成分，并對其所含的化學物質進行分析，通過室內生物測定法測定了其對伴生種三葉鬼針草（Bidens pilosa var. radiate Sch. Bip.）和假臭草[Praxelis clematidea （Griseb.） R. M. King et H. Rob.]的化感作用，旨為闡明化感作用在入侵植物小花寬葉十萬錯對入侵地鄰近植物的化感抑制作用，為進一步揭示其入侵的化學機制并制定合理的治理方法提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

試驗用小花寬葉十萬錯地上部分于2018年5月中旬采自海南省中國熱帶農業科學院儋州細胞樓實驗基地。受試材料三葉鬼針草、假臭草采自中國熱帶農業科學院儋州科技園區。

1.2方法

1.2.1小花寬葉十萬錯地上部分石油醚萃取相化學成分的提取取自然風干的小花寬葉十萬錯地上部分2.5 kg，切成小塊;在室溫下，用體積分數為95%的乙醇進行3次回流提取;合并提取物后減壓濃縮得粗浸膏，將粗浸膏溶解于水后用石油醚萃取，得到小花寬葉十萬錯石油醚萃取相。

1.2.2小花寬葉十萬錯萃取相化學成分分析取小花寬葉十萬錯石油醚萃取相，用三氯甲烷稀釋后進行氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）測定。氣相條件：色譜柱為FB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫為46 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升溫至310 ℃，保持12 min。運行時間為58 min;汽化室溫度為250 ℃;載氣為高純He（99.999%），載氣流量為1.0 mL/min;柱前壓為7.06 psi;分流進樣，分流比為20 ∶1;溶劑延遲時間為5 min。質譜條件：離子源為EI（非選擇性電離）源;質量范圍為29～500 amu;離子源溫度為230 ℃;四極桿溫度為150 ℃;接口溫度為280 ℃;電子能量為70 eV;發射電流為34.6 μA;倍增器電壓為1 612 V。對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist 2005和Wiley275標準質譜圖。

1.2.3種子萌發和幼苗生長抑制試驗將直徑為9 cm的培養皿洗凈、烘干、滅菌，鋪2層滅菌定性濾紙，分別加入濃度為0.05、0.025、0.012 5 g/mL的小花寬葉十萬錯石油醚萃取相水溶液5 mL，以蒸餾水為對照，設3個重復。待濾紙浸濕后將飽滿、大小均勻并催芽后的三葉鬼針草和假臭草種子各20粒放入培養皿中，置于人工氣候箱[濕度70%，溫度（25±2） ℃，光照時間14 h/d，光照度16 000 lx）]中恒溫培養。種子出現萌芽（胚根長度≥1 mm）后開始記錄每天種子的萌發數量，7 d后統計種子的發芽率并測量根長及莖長。

2結果與分析

2.1小花寬葉十萬錯石油醚萃取相主要化學成分

經GC-MS分析，共鑒定出29種化合物，占總量的97.917%，用峰面積歸一化法測定小花寬葉十萬錯石油醚萃取相的質量分數（圖1和表1）。結果顯示，小花寬葉十萬錯石油醚萃取相化學成分以醇類為主，占總量的51.384%，含量較高的成分依次為豆甾醇（15.578%）、穿貝海綿甾醇（13.987%）、反式植醇（11.653%）、二氫布拉西唑醇（7.142%）等;其次為酯類（18.372%），含量較高的成分分別為亞麻酸乙酯、棕櫚酸乙酯等;再次為烯烴類（16.264%）;此外還有酚、醛、酸等。

2.2小花寬葉十萬錯石油醚萃取相對伴生種種子萌發和幼苗生長的影響

2.2.1對伴生種種子萌發的影響不同濃度下小花寬葉十萬錯石油醚萃取相對三葉鬼針草、假臭草2種伴生種種子萌發都有明顯的抑制作用（圖2），隨著濃度的升高，抑制作用逐漸增強，但在相同濃度下2種伴生種的種子萌發率差異不顯著。以上結果說明，小花寬葉十萬錯石油醚萃取相具有抑制伴生種種子萌發的化感活性物質，且化感活性物質的化感作用隨著濃度升高逐漸增強。

2.2.2對伴生種三葉鬼針草、假臭草幼苗生長的影響在濃度為0.012 5、0.025 g/mL條件下小花寬葉十萬錯石油醚萃取相對伴生種三葉鬼針草根長的化感抑制作用大于對莖長的化感抑制作用，但隨著濃度升高，對根長的化感抑制作用差異不顯著（圖3）。在不同濃度下小花寬葉十萬錯石油醚萃取相對假臭草根長的抑制作用差異顯著，表現為隨著濃度升高，化感作用逐漸增強（0.012 5、0.025、0.05 g/mL濃度下化感效應敏感指數分別為-59.096%、-77.933%、-94.421 5%）;對莖長的作用表現為在濃度為0.05 g/mL下假臭草的莖長顯著低于對照組，但與0.012 5、0.025 g/mL差異不顯著（圖3）。

以上結果說明：小花寬葉十萬錯石油醚萃取相對三葉鬼針草、假臭草幼苗生長表現出一定的化感抑制作用，且對根長的抑制作用大于對莖長的抑制作用，但總體上來說，隨著濃度升高抑制作用逐漸增強。

3討論

化感作用是研究入侵植物入侵機制的重要途徑，多年來一直是研究熱點。已有研究結果表明，化感物質作為次生代謝物可通過化感作用影響植物的生長發育（如種子的萌發、幼苗的生長、成株的開花結實等），從而提高植物種群在生存競爭中的優勢地位，利于種群的擴大和繁衍[17]。植物中化感物質主要分為水溶性直鏈醇、有機酸、脂肪族醛和酮、簡單不飽和內酯、長鏈脂肪酸和多炔、醌類、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物等14類[2]。不同化感物質的化感作用也并不相同。水溶性有機酸、直鏈醇、脂肪族醛和酮大都能抑制種子的萌發[18-19];從豚草（Ambrosia artemisiifolia）、三裂葉豚草（Ambrosia trifida）和毛果破布草（Ambrosia psilostachya）中分離到的揮發性萜類具有降低大豆、洋蔥、燕麥、玉米和小麥種子發芽率并延遲發芽的作用[20]。而從菊科植物中分離到的酚類、有機酸類等化感物質可影響被感植物對礦質元素的吸收及干擾參與光合途徑的多種酶活性[21]。也有研究表明，從細葉亞菊中分離到的松柏醇能抑制垂穗披堿草（Elymus nutans Griseb.）的種子萌發和幼苗生長[22]。

在本研究中，小花寬葉十萬錯石油醚萃取相對供試植物表現出較強的生物活性，其中在不同濃度下小花寬葉十萬錯石油醚萃取相對伴生種種子萌發都有明顯的抑制作用，隨著濃度的升高，抑制作用逐漸增強;此外，小花寬葉十萬錯石油醚萃取相對三葉鬼針草、假臭草幼苗生長表現出一定的化感抑制作用。充分說明小花寬葉十萬錯石油醚萃取相對伴生種植物的種子萌發和幼苗生長表現出一定的化感抑制作用，且化感抑制作用隨濃度的升高而增強。根據供試植物的化感表現，筆者還對小花寬葉十萬錯石油醚萃取相的化學成分進行了GC-MS分析，結果顯示小花寬葉十萬錯萃取相化學成分主要含有醇類、萜類、酯類、酸類、酚類、醛類、酸類等。根據上述研究結果，其中也含有多種能引起化感作物的化學成分，然而要明確其具體的化感成分，有待以后進一步研究。本研究的重點結果是明確了小花寬葉十萬錯的入侵擴散具有化感侵入的重要性，也初步篩選了化感活性成分類型，為進一步研究小花寬葉十萬錯的入侵機制提供了科學依據;同時，本研究只選取石油醚萃取相進行化學成分及其化感活性研究，存在一定的局限性。在下一步的工作中應在活性篩選下開展小花寬葉十萬錯乙酸乙酯萃取相、三氯甲烷萃取相、石油醚萃取相中化感物質的分離純化。

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