烏頭霜霉病病原菌生物學特性及致病力

王婷 陳茂婷 王卓源 周丹 王光志

摘要：通過系統測定烏頭霜霉病病原菌的生物學特性，研究其致病力，為烏頭霜霉病的深入研究和防治提供理論依據。采用懸滴法研究環境條件溫度、pH值、碳源對孢子囊萌發的影響，采用硫酸法控制小容器內相對濕度，測定相對濕度對孢子囊萌發的影響，并用離體葉盤法接種霜霉菌孢子囊懸浮液觀察烏頭發病情況并統計病情指數。結果顯示，孢子囊在4～25 ℃范圍內均可萌發，18 ℃時萌發率最高;相對濕度低于95%時孢子囊不能萌發，在相對濕度為100%時孢子囊萌發率最高，水分為孢子囊萌發的必需條件;孢子囊在pH值為5.74～8.06的條件下均可萌發，且在pH值為5.93 時萌發率最高;在4種供試碳源的培養條件下，孢子囊都可萌發，其中可溶性淀粉培養條件下孢子囊萌發率最高。接種48 h后，葉背面初現水漬狀病斑，2.5 d后可以看到明顯病斑，呈彌散型，7 d后病斑開始壞死。觀察期內，隨著接種時間的延長，病情指數逐漸升高。該研究明確了不同環境條件下烏頭霜霉病病原菌的生物學特性，為該病的深入研究提供了理論依據。

關鍵詞：烏頭;霜霉病;病原菌;孢子囊;生物學特性;致病力;離體葉盤法;病情指數

中圖分類號： S435.67文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0172-03

收稿日期：2018-08-20

基金項目：四川省教育廳重點項目（編號：15ZA0098）。

作者簡介：王婷（1993—），女，四川達州人，碩士研究生，研究方向為中藥資源學。E-mail：1747817056@qq.com。

通信作者：王光志，博士，教授，研究方向為中藥資源學。E-mail：kzwon@163.com。

烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）為毛茛科烏頭屬藥用植物，其干燥母根稱川烏，子根的加工品稱附子，均為川產道地藥材，療效好，用量大。烏頭在四川省栽培面積廣，在道地產區江油地區有1 900多年的種植歷史。在多年栽培過程中，烏頭病害頻發，其中以根腐病、白絹病、霜霉病對產量的影響較大。霜霉病在苗期尤為普遍，一般發病率為3%～20%，最高達30%[1];烏頭霜霉病具有發病率高、傳染性強的特點，重病苗最后褐化枯死，造成缺株，對附子藥材的產量造成嚴重影響，也對藥農造成了嚴重的經濟損失。余永年在1979年首次對烏頭霜霉病進行報道，將該病病原菌鑒定為烏頭霜霉Peronospora aconiti Yu[2]，該菌為專性寄生真菌。筆者所在課題組前期對四川省江油地區烏頭種植基地感病烏頭做了初步探索研究，根據病原菌形態學特征以及rDNA-ITS區序列對其進行了鑒定[3]。本研究探討了烏頭霜霉病致病菌的生物學特性和致病性特征，以期進一步為該病害的深入研究提供理論依據和基礎。

1材料與方法

1.1樣品采集

烏頭霜霉病病葉采自四川省江油市太平鎮普照村附子種植基地（104°41′27″E、31°43′47″N），海拔512 m。病葉采集后裝于無菌密封袋中，置于采樣箱中帶回。健康葉采自成都中醫藥大學藥用植物園內栽培的健康植株。以上供試材料的來源均經成都中醫藥大學中藥資源教研室王光志教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭（A. carmichaeli Debx.）。

1.2孢子囊懸浮液制備

用流動自來水將采集病葉表面的泥土等雜質沖洗干凈，經無菌蒸餾水潤洗后用滅菌濾紙吸干表面水分，在18 ℃、相對濕度為100%的黑暗條件下過夜培養[4]。培養后用無菌毛刷刷下新鮮孢子囊，以無菌蒸餾水配制新鮮孢子囊懸浮液，4層滅菌紗布過濾即得。

1.3烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發方式觀察

參照崔鐵軍等的方法[5]并稍作改動，新鮮孢子囊懸浮液在18 ℃下培養24 h后吸取少量懸浮液制片并于顯微鏡下觀察。

1.4烏頭霜霉病病原菌生物學特性測定

1.4.1溫度對烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發的影響

懸滴法培養新鮮孢子囊懸浮液[6]。分別置于溫度為0、4、10、16、18、22、25 ℃下，于3、6、8、12、24 h后分別鏡檢孢子囊萌發率，每處理設3次重復，每重復觀察不少于200個孢子囊。

1.4.2相對濕度對烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發的影響

采取新發病葉片，將孢子囊彈撒在載玻片上，在干燥器內用硫酸法控制濕度[7]，置于相對濕度分別為90%、95%、98%、100%的干燥器中，18 ℃下培養，以蒸餾水為對照，3、5、10、24、36 h后分別鏡檢孢子囊萌發率。每處理設3次重復，每重復觀察不少于200個孢子囊。

1.4.3pH值對烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發的影響

用Na2HPO4和NaH2PO4配制pH值5.74～8.06范圍內7個不同梯度的磷酸緩沖液，室溫下懸滴法培養，3、6、9、12、24 h后鏡檢孢子囊萌發率。每處理設3次重復，每重復觀察不少于200個孢子囊。

1.4.4碳源對烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發的影響

用無菌蒸餾水分別配制葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉及甘油溶液，使其濃度均為5%，室溫下懸滴法培養，3、6、9、12、24 h后鏡檢孢子囊萌發率。每處理設3次重復，每重復觀察不少于200個孢子囊。

1.5烏頭霜霉病病原菌的致病力研究

取健康烏頭植株頂端第2張至第3張真葉，自來水沖洗干凈表面雜質，75%乙醇浸泡30 s，滅菌蒸餾水潤洗3次，無菌濾紙吸干表面水分[8]。健康葉片消毒后，取葉尖部分制成直徑為10 mm的葉盤。將葉盤和完整葉片放入0.8%水瓊脂培養皿中，每皿5個葉盤或1張整葉，葉背朝上。每個葉盤點滴法接種35 μL孢子囊懸浮液，整葉均勻點接孢子囊懸浮液，每點5 μL，對照組接種等量滅菌蒸餾水[9]。接種后放置于18 ℃、相對濕度為100%的培養箱中，12 h光照/12 h黑暗條件下培養。每天觀察并拍照記錄離體健康葉的變化，統計病情指數（烏頭霜霉分級標準見表1），7 d后每天取1組葉片撕取表皮進行顯微觀察，直至葉片壞死。

2結果與分析

2.1烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發方式

如圖1所示，孢子囊以形成芽管的方式萌發，可產生1個或2個芽管，芽管可形成分支，未見游動孢子囊形成。

2.2溫度對烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發的影響

在供試溫度范圍內，0 ℃條件下無孢子囊萌發，4～25 ℃范圍內孢子囊均可萌發，但4 ℃條件下前9 h無孢子囊萌發。孢子囊萌發率隨溫度升高呈先升高后降低的趨勢，18 ℃ 時達最大值（表2）。溫度過低或過高都會降低孢子囊萌發能力。

2.3相對濕度對烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發的影響

孢子囊在相對濕度98%～100%范圍內可萌發，相對濕度≤95%時，孢子囊不萌發，且相對濕度98%與相對濕度100%條件下孢子囊萌發率差異較大。在供試相對濕度范圍內，相對濕度為100%條件下孢子囊萌發率最高。但對照組蒸餾水條件下孢子囊萌發率高于供試組（表3）。

2.4pH值對烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發的影響

pH值5.74～8.06范圍內烏頭霜霉病病原菌孢子囊均可萌發，在pH值為5.93時孢子囊萌發率最高（表4）。

2.5碳源對烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發的影響

在4種供試碳源處理下，烏頭霜霉病病原菌孢子囊均可萌發，且以可溶性淀粉作為碳源時孢子囊萌發率最高（表5）。

2.6烏頭霜霉菌致病力

形態學觀察結果顯示，接種2 d后，葉背面初現水漬狀病斑，病斑新增速度較快，對照組接種點2 d沒有病斑顯現。接種2.5 d后，可看到明顯病斑，呈彌散型。病斑于7 d后增長速度減緩，且葉背開始壞死，壞死病斑呈棕褐色。對照組開始壞死時間與試驗組相差不大。由圖2可知，觀察期內隨著培養時間的延長，病情指數顯著增長，從0增長至77.8%。接種7 d后，孢子囊大量萌發;接種10 d后，葉片開始腐爛。

3結論與討論

余永年于1979年首次對烏頭霜霉病進行報道，首次發現致病菌為霜霉屬新種烏頭霜霉（P. aconiti Yu）?并于1984年補充了對烏頭霜霉卵孢子的描述[2]，此后未見烏頭霜霉相關研究報道。筆者所在課題組歐洪根據病原菌形態學特征以及rDNA-ITS區序列2個方面對病原菌進行了鑒定，明確了病原菌的分類地位;同時初步研究了烏頭霜霉病的傳播機制，并建立了快速分子檢測病原菌的方法[3]。李娜等以四川省江油地區栽培烏頭為研究對象，探索了烏頭葉面微生物菌群動態變化特征及其與烏頭霜霉病的相關性[10]。江油地區的藥農目前多用多菌靈防治烏頭霜霉病，但效果甚微。關于烏頭霜霉病病原菌生物學特性的研究鮮有報道?；诖耍驹囼炘诠P者所在課題組前期鑒定烏頭霜霉病病原菌為烏頭霜霉的基礎上，就不同溫度、pH值、相對濕度、碳源等環境因素對烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發的影響進行了對比分析。

霜霉目真菌主要通過在菌絲分化的或不分化的孢囊梗上產生孢子囊而進行無性繁殖，孢子囊萌發產生游動孢子或直接產生芽管，然后發育成菌絲，霜霉屬卵菌的孢子囊萌發方式為直接萌發產生芽管[12]，單軸霉屬的葡萄霜霉以產生游動孢子的方式萌發[13]。本試驗觀察到烏頭霜霉僅以孢子囊形成芽管的方式萌發，未見游動孢子釋放。在崔鐵軍等的研究中，寄生霜霉孢子囊萌發除了以產生芽管的方式外還可以通過形成孢囊梗產生次生孢子囊[5]。烏頭霜霉與寄生霜霉同為于卵菌門（Oomycota）霜霉目（Peronosporales）霜霉科（Peronosporaceae）霜霉屬（Peronospora）。但在本試驗中，未見次生孢子囊。

初步研究表明，在供試溫度條件范圍內，孢子囊在4～25 ℃ 范圍內均可萌發，但4 ℃條件下孢子囊萌發率較低且前9 h無孢子囊萌發，0 ℃時孢子囊無萌發力，孢子囊萌發的最適溫度為18 ℃。江油地區的烏頭霜霉病多暴發于3—4月，這與烏頭霜霉病病原菌萌發的最適溫度很可能有關。李金花等在罌粟霜霉病病原菌及其生物學特性研究中表明，孢子囊在最適溫度16 ℃條件下培養24 h，萌發率為58.5%[7]。在王艷等對菘藍霜霉病病原菌生物學特性研究中，霜霉菌孢子囊在最適溫度16 ℃條件下培養24 h，萌發率為3400%[13]。本試驗結果與之相比明顯偏低，這可能是病原菌寄主不同所導致的。

在供試pH值條件下，孢子囊均可萌發，孢子囊萌發的最適pH值為5.93，試驗表明弱酸性有利于烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發。劉紹芹對三裂葉豚草霜霉菌生物學特性研究顯示，在最適pH值8條件下的孢子囊培養12 h，萌發率為4330%[14]。本試驗顯示，在最適pH值5.93條件下培養24 h，萌發率為7.25%，這可能與江油烏頭種植地區土壤酸堿性有關。這為烏頭霜霉病的防治提供了一條新的思路，也許可以通過調節烏頭種植的土壤pH值來降低烏頭霜霉病染病率。此外，在不同pH值的緩沖液中孢子囊萌發率都比在蒸餾水條件下的孢子囊萌發率低，這表明不同pH值的緩沖液都可以抑制孢子囊的萌發，對此有待進行更深層次的研究。

在供試相對濕度范圍內，孢子囊在相對濕度95%以下不能萌發;相對濕度98%時孢子囊萌發率較低，且前10 h無孢子囊萌發，至24 h孢子囊萌發率僅為1.00%;相對濕度100%時孢子囊萌發率達到最大值，36 h孢子囊萌發率為11.50%;蒸餾水條件下孢子囊36 h萌發率則達到了14.00%，表明水分為孢子囊萌發的必需條件。而江油地區3—5月是感染傳播霜霉病的高發時節，且多雨。在王艷等所做的菘藍霜霉病原菌及其生物學特性研究中，相對濕度100%條件下孢子囊36 h萌發率為3.20%，蒸餾水中孢子囊36 h萌發率為18.33%[13]，本試驗與其結果相近。

在葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘油這4種供試碳源中，可溶性淀粉培養條件最適合孢子囊萌發，該條件下培養24 h萌發率為9.00%。在劉旭等對不同地區葡萄霜霉病病菌生物學特性研究中，重慶地區的葡萄霜霉菌在葡萄糖、麥芽糖、蔗糖這3種碳源條件下培養24 h，孢子囊萌發率分別為6252%、56.17%、62.16%，陜西地區的葡萄霜霉菌在這3種碳源條件下培養24 h，孢子囊萌發率分別為43.75%、3831%、49.47%[15]。不同地區的同一種霜霉菌在相同條件下的孢子囊萌發率具有明顯差異，土壤營養成分可能也是影響孢子囊萌發率的主要因素之一。

孢子囊懸浮液接種1 d后，葉片表面未觀察到病斑的形成，病情指數仍然為0，接種2 d后葉背開始出現水漬狀病斑，同時病情指數經統計為11.1%，這與司勝偉觀察的黃瓜霜霉病病情指數較為接近[16]。之后病斑擴散速度較快，病情指數也隨之增加。接種7 d后病情指數增長速度放緩，壞死病斑也開始出現，但壞死病斑出現時間與李佩芳觀察到的時間[17]有所出入。

綜上，在離體條件下孢子囊萌發率均較低，但在烏頭葉片上接種孢子囊懸浮液后，觀察到葉片上的孢子囊幾乎全部產生芽管萌發，推測寄主選擇性是烏頭霜霉萌發的重要因素。與其他學者關于不同植物的霜霉病病原菌生物學特性研究結果相比，烏頭霜霉病病原菌孢子囊萌發率普遍偏低。如常永義等在全球紅葡萄霜霉病病菌生物學特性研究中，發現清水中培養24 h孢子囊萌發率高達89.25%[18]。在王艷等的研究中，與烏頭霜霉同為霜霉屬的菘藍霜霉在清水中最高萌發率也較低，為34%[13]。這可能與霜霉病病原菌的種屬來源、寄主以及不同霜霉菌萌發方式不同有關。鑒于烏頭霜霉菌專性寄生的特點，烏頭霜霉可能只在寄主烏頭葉片上大量萌發，離體情況下無法大量萌發。本研究明確了烏頭霜霉在不同環境條件下的生物學特性及其致病力，旨在為烏頭霜霉病的相關研究奠定基礎，為該病的發生與防治提供理論依據。附子及川烏作為川產道地藥材，烏頭霜霉病的發生嚴重影響了其產量和質量，目前對該病害的發生和防治均未引起足夠重視。因此，須要盡快開展針對該病害的抗病品種選育工作，從源頭保證烏頭植株的健康，同時還應該篩選出高效防治藥劑，從而有效控制烏頭霜霉病的發生和蔓延。

參考文獻：

[1]唐莉，梁麗娟，葉華智，等. 附子常見病害的調查研究[J]. 現代中藥研究與實踐，2004，18（6）：29-32.

[2]余永年. 霜霉一新種[J]. 植物病理學報，1979，9（2）：127-130.

[3]歐洪. 烏頭霜霉病病原物鑒定及傳播機制初步研究[D]. 成都：成都中醫藥大學，2016.

[4]Wong F P，Wilcox W F. Distribution of baseline sensitivities to azoxystrobin among isolates of Plasmopara viticola[J]. Plant Disease，2007，84（3）：275-281.

[5]崔鐵軍，劉躍庭，羅加鳳，等. 寄生霜霉Peronospora parasitica（Pers.） Fr.孢子囊萌發方式的觀察[J]. 菌物學報，2008，27（5）：775-777.

[6]劉寶玉，王玉杰，曾軍，等. 無殼葫蘆根腐病病原菌的鑒定及生物學特性初步研究[J]. 植物保護，2010，36（5）：82-85.

[7]李金花，柴兆祥，董克勇，等. 罌粟霜霉病病原及其生物學特性[J]. 中國中藥雜志，2002，27（3）：176-179.

[8]Kong X J，Qin W T，Huang X Q，et al. Development and application of loop-mediated isothermal amplification （LAMP） for detection of Plasmopara viticola[J]. Scientific Reports，2016，6：28935.

[9]Yu Y，Zhang Y L，Yin L，et al. The mode of host resistance to Plasmopara viticola infection of grapevines[J]. Phytopathology，2012，102（11）：1094-1101.

[10]李娜，胡亮，王婷，等. 烏頭葉面微生物菌群變化特征及其與烏頭霜霉病相關性[J]. 中國實驗方劑學雜志，2017，23（5）：42-46.

[11]余永年. 中國真菌志第六卷[M]. 北京：科學出版社，1998.

[12]Abdalla M A，Win H Y，Islam T，et al. Khatmiamycin，a motility inhibitor and zoosporicide against the grapevine downy mildew pathogen Plasmopara viticola from Streptomyces sp. ANK313[J]. The Journal of Antibiotics，2011，64（10）：655-659.

[13]王艷，陳秀蓉. 菘藍霜霉病原及其生物學特性研究[J]. 中藥材，2008，31（12）：1782-1784.

[14]劉紹芹. 三裂葉豚草霜霉菌生物學特性及其致病機理研究[D]. 沈陽：沈陽農業大學，2006.

[15]劉旭，梁曼，王陽，等. 不同地區葡萄霜霉病菌生物學特性及致病力研究[J]. 北方園藝，2013（6）：119-122.

[16]司勝偉. 依據過敏性反應劃分黃瓜抗霜霉病類型[D]. 鄭州：河南農業大學，2011.

[17]李佩芳. 黃瓜霜霉病過敏性反應的研究[D]. 鄭州：河南農業大學，2013.

[18]常永義，朱建蘭. 全球紅葡萄霜霉病防治及病菌生物學特性研究[J]. 中外葡萄與葡萄酒，2001（1）：17-20.