瀕危藥用植物青天葵內生真菌的鑒定及抑菌活性研究

宋利沙 蔣妮 藍祖栽 郭曉云 張占江

摘要：研究廣西青天葵內生真菌的抗菌活性，并篩選出具有抗菌活性的菌株。從廣西青天葵植株中共分離得到23株內生真菌，以15種病原真菌為指示菌株，用平板對峙法對分離的內生真菌進行抑菌試驗，結果顯示，內生真菌MQY-1對多種病原真菌指示菌具有較強的抗菌活性，結合其形態特征和分子生物學分析結果，將其鑒定為Colletotrichum truncatum，證明青天葵中存在一定的抗菌活性物質，為尋找新型抑菌物質提供一定基礎。

關鍵詞：藥用植物;內生真菌;青天葵;抑菌活性;拮抗真菌;抑菌譜

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0175-04

收稿日期：2019-01-26

基金項目：廣西藥用植物園青年基金（編號：桂藥基201801）;廣西科技基地人才專項（編號：桂科AD16380013）;有機藥材種植與評價研究團隊（編號：桂藥創2019007）;中央引導地方科技發展專項（編號：桂科ZY1949023）;廣西壯族自治區中醫藥管理局項目（編號：gzzc1225）。

作者簡介：宋利沙（1987—），女，河南鶴壁人，博士，助理研究員，主要從事中藥材病蟲害防治研究。E-mail：lishasong@126.com。

通信作者：蔣妮，碩士，副研究員，主要從事中藥材病蟲害防治研究。E-mail：jiangni292@126.com。

青天葵[Nervilia fordii（Hance）Schltr.]屬蘭科芋蘭屬植物，別稱獨葉蓮、珍珠葉、天葵、地沙、半邊傘、青蓮、芋蘭等，主要分布在廣東、廣西和海南等地，生長于海拔400～600 m的山林陰濕處、田邊等，首載于《嶺南采藥錄》，為華南地區的特有藥材。全草可供藥用，性寒味甘，具有潤肺止咳、清熱解毒、散瘀止痛等功效，主治肺癆咯血、肺熱咳嗽、口瘡、咽喉腫痛、跌打損傷等癥[1-7]。

內生真菌是指在其生活史的某一時期生活在不同植物組織內，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的一類真菌，普遍定殖在健康植物組織和器官中，種類繁多，分布廣泛[8]。近年來的研究表明，從健康藥用植物的不同組織器官中可分離到多種內生真菌，采用不同的培養基可篩選出多種能夠產生抑制病原真菌的活性物質的內生真菌，如從人參中分離到的2株內生真菌Fusarium sp.PN8和Aspergillus sp.PN17，具有抗菌活性，并可用于發酵制備人參皂苷等成分[9];從印度藥用植物黃花稔（Sida acuta）中分離得到的具有抗菌活性的硫色曲霉（Aspergillus sulphureus），可抗金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌[10];Shah等發現，光果甘草的內生真菌腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）具有抗結核的作用[11];從印度芳香植物檸檬馬薄荷（Monarda citriodora）中分離得到28株內生真菌，分別來自11個屬，包括鐮刀菌、黃曲霉、毛孢霉屬（Muscodor）等，具有開發植物生物防治物質的潛力[12];Gupta等發現，姜黃（Curcuma longa）的內生真菌草莖點霉（Phoma herbarum）具有拮抗斑葉病的活性等[13]。本試驗從藥用植物青天葵的球莖、莖、葉中進行內生真菌分離，并初步篩選出抗菌活性較強的內生真菌菌株，旨在為尋找新的抗菌藥物資源提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試指示菌

供試的15種病原真菌分別為三七灰霉病菌（Botrytis sp.）、三七根腐病菌（Fusaium solani）、豆蔻葉斑病菌（Phyllosticta sp.）、香蕉葉斑病菌（Alternaria sp.）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、苦玄參葉斑病菌（Alternaria sp.）、香蕉炭疽病菌（Colltetorrichum sp.）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、三七黑斑病菌（Alternaria panax）、廣西莪術葉斑病菌（Phomopsis sp.）、煙草灰霉病菌（Botrytis cinerea）、三七炭疽病菌（Colltetorrichum gloeosporioides）、艾納香褐斑病菌（Phoma sp.）、腫節風黑斑病菌（Colletotrichum dematium）、羅漢果葉斑病菌（Stagonosporopsis cucurbitacearum），均是由筆者所在植物病理研究室保存的菌株。

1.1.2供試樣品

2018年11月在廣西馬山縣青天葵種植區（108.17°E，23.72°N）采集青天葵健康植株的球莖、莖、葉并進行編號，封存于保鮮袋中，48 h內完成內生真菌的分離。

1.1.3供試培養基

供試培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基，其組成為馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1 L，用于植物病原真菌培養和菌株拮抗效果測定。

1.2試驗方法

1.2.1內生真菌的分離和純化

采用常規組織分離法，參考Guo等的方法[14]并進行改進，取健康青天葵的根、莖、葉用無菌水洗凈，晾干，剪成長寬均為5 mm左右的小塊，在無菌操作臺上，用75%乙醇表面消毒30 s，0.1% HgCl2消毒3 min，再用75%乙醇表面消毒30 s，最后用無菌水沖洗3次，將根、莖、葉的小塊接種于PDA平皿中，于28 ℃條件下恒溫培養，待菌落長出，挑取尖端菌絲純化培養。純化后的菌株保藏于廣西壯族自治區藥用植物園病理研究室。

1.2.2內生真菌的抗菌篩選

采用平板對峙法[15-16]進行拮抗真菌的初篩，在直徑為9 cm的盛有PDA培養基的平板中央接種直徑為5 mm的病原菌組織塊，在距該病原菌組織塊2 cm 的3個角點處等距離接種生防真菌，以只接種病原菌菌塊為對照。每個處理設3次重復，于28 ℃ 條件下恒溫培養，7 d后測抑制率大小，篩選出對病原真菌有拮抗作用的內生真菌。復篩與初篩方法一樣。

1.2.3內生真菌抗菌譜的測定

抗菌譜測定方法參考“122”節，測量病原菌菌落直徑和抑制率;將直徑為6 mm的內生真菌菌塊組織置于已加入混懸液的PDA固體培養基上，測量抑菌圈直徑。

1.2.4內生真菌的鑒定

1.2.4.1形態鑒定

將拮抗真菌在PDA培養基上培養7～15 d，記錄菌落形態[17]，在光學顯微鏡下，觀察并記錄其分生孢子和子實體結構的形態特征。

1.2.4.2分子生物學鑒定

采用MightyAmp DNA Polymerase Ver.3（1.25 U/50 μL）（TAKARA BIO INC.，Japan，cat. no. R076A）試劑盒，挑取培養拮抗真菌的菌落作為模板直接用于PCR反應。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。擴增反應在50 μL反應體系中進行，包括2×MightyAmp buffer （1×） 25 μL、10×Addtitive for High Specificity（1×） 5 μL、正反引物各1.5 μL（15 pmol），加ddH2O定容至50 μL。PCR反應程序如下：98 ℃預變性2 min;98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸60 s，40個循環;最后在68 ℃下延伸10 min。空白對照為ddH2O。吸取2.5 μL PCR產物加入1%（W/V）瓊脂糖凝膠的孔中，將凝膠置于1×TAE緩沖液中，在130 V下電泳30 min，用凝膠成像法檢測目的條帶。將有目的條帶的PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果與美國國立生物技術信息中心（NCBI）GenBank中的序列進行BLAST比對。利用MEGA 6.0軟件的鄰位連接法（Neighbor-Joining法）構建內轉錄間隔區（ITS）rDNA的系統發育樹。

真菌種屬地位的確定，依據目標序列和參考序列進行BLAST比對之后，同源性≥95%，將其暫定為同1個屬;相似性≥99%，暫定為同1個種。

1.2.5內生真菌菌落形態觀察

用光學顯微鏡觀察處理菌株和對照菌株菌絲體的形態特征，拍照并記錄。

2結果與分析

2.1內生真菌的分離

通過常規組織分離法，從青天葵的塊莖、莖和葉中共分離得到23株內生真菌純化菌株，其中葉中9株，莖中11株，塊莖中3株，可以看出莖的分離率最大，達47.83%，其次是葉（39.13%）和塊莖（13.04%）。針對這23株真菌菌株，在不同組織中選出不同的形態類型，共計13株進行分子鑒定（表1）。

2.2內生真菌的鑒定

“2.1”節中的13株菌株經PCR反應和測序得到的序列與Genbank中5株真菌的參考序列相似性達到99%，屬于同屬不同的種。基于ITS構建的系統發育樹（圖1）顯示，這13株青天葵內生真菌屬于5個不同分支，并有較高的支持率。MQY-1、MQY-3、MQJ-2、MQJ-9這4株菌株在同一個分支上，屬于平頭刺盤孢[Colletotrichum truncatum（KX364059）];MQJ-11和MQJ-12構成一個支持強度很高的分支，屬于博寧刺盤孢[Colletotrichum boninense（KX343044）];MQJ-4與暹羅刺盤孢[Colletotrichum siamense（KY421040）]構成一個分支，支持率達到99%;MQKJ-1、MQKJ-2和MQY-6聚類在一起，該類群屬于膠孢炭疽菌膠胞刺盤孢[Colletotrichum gloeosporioides（MH790247）]。可見，這13株菌株都屬于刺盤孢屬（Colletotrichum sp.），占分離總數的56.52%，是青天葵內生真菌的優勢菌群。

2.3內生真菌的抗菌活性

以15種病原真菌為指示菌，采用平板對峙法進行青天葵內生真菌的抑菌活性研究，結果表明，23株內生真菌中，只有MQY-1對這15種病原真菌均有較強的抗菌活性，平均抑制率達65.00%（表2），具有抑菌廣譜性;其中對煙草灰霉病和三七灰霉病抑制率較高，分別為89.70%、80.00%;而對豆蔻葉斑病、羅漢果葉斑病、香蕉枯萎病和西瓜枯萎病的抑制率較低，分別為51.88%、53.59%、54.02%、55.56%。

2.4抑菌活性菌株的形態特征

MOY-1具有抗菌廣譜性，因此，在生物顯微鏡下對該菌的形態特征進行觀察和鑒定。圖2顯示，該菌株菌落表層有1層白色絨狀的菌絲，生長較快，不產分生孢子。綜合其形態學特征和分子生物學分析結果鑒定該菌株為C. truncatum。

3討論與結論

藥用植物內生真菌普遍存在于健康植物的不同組織和器官中，種類多樣，且分布廣泛。青天葵是我國特有的瀕危藥用植物，在自然條件下生長很慢，主要靠球莖繁殖，其球莖休眠期可長達6個月，無法滿足人類對其有效成分的臨床需求。內生真菌可存在于不同的植物中，與宿主植物長期協同進化，在此漫長的共同進化過程中，彼此形成平衡穩定的互利共生和特殊的寄生關系[8]。許多內生真菌不僅從宿主植物中吸取營養物質滿足自身生長發育需要，而且可提高宿主植物對環境脅迫的抗性，如抗病蟲害、抗干旱等抗性;同時，也可產生具有生物活性的次生代謝產物，為開發新藥和新的化合物提供重要依據。

本研究從青天葵的塊莖、莖和葉中分離得到23株內生真菌，不同組織內生真菌分布不同，以莖中的內生真菌數量最多，而塊莖中分離得到的內生真菌數量最少，原因可能是地上部分和地下部分環境差異較大。這23株菌株鑒定屬于同一個屬，可以看出，青天葵內生真菌資源單一，與其他植物存在差異[18]，需要從不同采樣點采用不同分離方式進行再次分離鑒定方能驗證。對這23株內生真菌進行抑菌活性的篩選，獲得1株抑菌活性較強的菌株MQY-1（C. truncatum），該菌株對多種病原真菌有一定的抑制作用，具有一定的應用價值，其具有生物活性的次生代謝產物、發酵工藝的優化以及其對植物生長的影響等方面還有待進一步深入研究。

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