豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌分離鑒定及floR基因檢測

羅行煒 孫華潤 魏單單 朱瑩瑩 徐引弟 賀丹丹 劉建華 潘玉善 吳華 苑麗 胡功政

摘要：為探究豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（APP）臨床分離株對氟苯尼考（FFC）的耐藥性及floR基因的流行與分布情況，收集河南、湖北、江西、陜西、湖南、山西、安徽等7個省份合作豬場送檢的病死豬肺臟、脾臟、支氣管黏液等206份病料樣本，從中分離APP并鑒定，采用微量肉湯稀釋法測定分離菌株對FFC的敏感性，PCR及測序方法檢測floR基因，并用隨機引物PCR（AP-PCR）方法分析臨床分離菌株之間的同源性。結果表明，成功分離鑒定了APP 28株，分離率為13.59%。4株APP對FFC耐藥，耐藥率為14.29%;15株攜帶floR基因，floR檢出率為53.57%，高于APP對FFC的耐藥率;有11株分離菌floR陽性但對FFC并不耐藥。分析RAPD系統樹狀圖發現，28株APP被分為幾乎無核苷酸同源性的A和B 2大類、25種RAPD型，其中A類25株，分22種RAPD型，14株攜帶floR基因，這些菌株間的核苷酸同源性為40%～80%;B類3株，分3種RAPD型，1株攜帶floR基因。本研究提示APP的floR基因主要以水平方式傳播。

關鍵詞：豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌;PCR;耐藥性;floR基因;隨機擴增多態性DNA（RAPD）

中圖分類號： S852.61文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0228-04

收稿日期：2018-08-09

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2016YFD0501304）。

作者簡介：羅行煒（1993—），男，河南光山人，碩士研究生，主要從事細菌耐藥機制研究。E-mail：1272376863@qq.com。

通信作者：胡功政，教授，博士生導師，主要從事細菌耐藥機制研究。E-mail：yaolilab@163.com。

豬傳染性胸膜肺炎是一種高度特異性傳染性豬呼吸道類疾病，在我國集約化養殖場尤為多見，引起該病發生的病原為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（APP）。我國自1987年首次發現此病例以來，某些地區已成功分離鑒定出病原菌APP[2-5]，如錦州地區[2]、江蘇泰興[3]、湖北[4]、貴州[5]等。近年，APP臨床分離株的耐藥現象越來越嚴重，其中APP對氟苯尼考（FFC）的耐藥性也已受到國內外專家學者的關注[5-11]。FFC作為動物專用的酰胺醇類廣譜抗生素，對APP的最小抑菌濃度為0.20～1.56 μg/mL，主要用于巴氏桿菌引起的牛呼吸道感染、豬傳染性胸膜肺炎、雞大腸桿菌病等[6]。細菌對FFC等酰胺醇類藥物耐藥的機理之一在于floR基因的介導，即floR基因編碼耐FFC或氯霉素的外排泵蛋白，從而導致這類藥物很難進入或不能進入細菌體內發揮作用[12]。

由于菌株分離時間及分離地點的不同，導致不同地域或不同季節的APP分離株對FFC的耐藥情況呈現較大差異。本研究對來自河南（焦作、中牟、安陽等）、湖北、江西、陜西、湖南、山西、安徽等7個省份疑似病豬的肺臟、脾臟、支氣管等病變組織進行目的菌分離鑒定，測定APP分離株對FFC的敏感性，進一步檢測其floR基因的攜帶情況，并運用隨機引物PCR（AP-PCR）技術檢測APP的隨機擴增多態性DNA（RAPD）圖譜，根據聚類結果分析分離株的同源性，為集約化養豬場合理使用FFC及進一步研究APP分離株floR基因的傳播機制提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料的采集

病料主要來自河南（焦作、中牟、安陽等）、湖北、江西、陜西、湖南、山西、安徽等7個省份地區養豬場的患病豬，取病變的肺臟、脾臟、支氣管等組織樣品，共206份。

1.1.2標準菌株

APP標準菌株（ATCC27090），購自中國普通微生物菌種保存中心。

1.1.3培養基及相關試劑

培養基：胰蛋白大豆營養瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB）、巧克力色血瓊脂平板，均購自北京奧博星生物技術有限責任公司。其中，TSA和TSB均分別加0.01% NAD和5%血清。

新生小牛血清，購自北京索萊寶生物科技有限公司。

相關試劑：2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、DSTM2000 DNA Marker，均購自康為世紀（北京）生物科技有限公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、50×TAE、1×TE（pH值=80），均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

各種生化鑒定管（試劑），購自山東青島海博生物技術有限公司。

1.1.4引物設計與合成

APP的所有血清型中都存在ApxⅣ基因，在GenBank上下載ApxⅣ基因片段序列（登錄號：AF021919.1），設計并合成ApxⅣ擴增引物;floR引物參照Bossé等的試驗[8];AP-PCR的引物參照Lee等的試驗[13]，引物序列見表1，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.1.5藥物

氟苯尼考原料（英文簡稱：FFC;含量：95%），由河南牧翔動物藥業有限公司提供，有效期內進行使用。

1.2方法

1.2.1病原菌分離與鏡檢

在無菌超凈操作臺中，分別從豬的肺臟、脾臟、支氣管等病料組織中取樣，劃線接種于巧克力色血瓊脂平板和TSA平板，37 ℃恒溫培養20 h。觀察細菌的菌落形態，挑取疑似APP菌落接種于TSB中。經多次接種純化培養，將已分離純化的菌株進行革蘭染色，在油鏡下觀察并記錄菌體的形態特征。

1.2.2分離菌株的生化試驗鑒定

將純化后的細菌純培養物接種于含0.01% NAD和5%血清的生化鑒定管中，然后置于37 ℃、10% CO2培養箱中培養24 h，觀察并記錄生化反應結果。

1.2.3分離菌株的PCR鑒定

挑取純化后的單菌落，于TSB中接種，氣浴恒溫搖床進行37 ℃培養20～24 h后，菌液PCR鑒定。PCR反應體系：2×PCR Taq Master Mix12.5 μL，ApxⅣ上、下游引物各1.0 μL，模板DNA 3.0 μL，ddH2O7.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。分別以TSB和標準菌株ATCC 27090為陰性或陽性對照。經1%瓊脂糖凝膠電泳后，陽性PCR產物回收，送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果在NCBI網站上進行BLAST進行比對。

1.2.4藥物儲備液配制

采用分析天平精確稱取適量FFC，再采用高壓后的去離子水（適量添加助溶劑N，N二甲基亞酰胺及乙醇）配制初始濃度為5 120 μg/mL的儲備母液，置于4 ℃ 冰箱保存備用。

1.2.5藥敏試驗

參照臨床與實驗室標準協會（CLSI）執行標準，采用微量肉湯稀釋法測定FFC對分離菌株的最小抑菌濃度（MIC）[14]，按照CLSI標準判讀并計算MIC50、MIC90和耐藥率。以標準菌株ATCC 27090為質控菌。

1.2.6細菌基因組DNA的制備

將APP菌株接種于TSB中，37 ℃培養10～12 h，離心收集菌體后用300 μL 1×TE（pH值=8.0）緩沖液重懸菌體，煮沸10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，上清即為細菌基因組，用1.5 mL Eppendorf管收集，-20 ℃儲存。

1.2.7floR基因檢測

以APP分離株基因組DNA為模板，設計相關引物（表1）進行PCR檢測，反應體系：2×PCR Taq Master Mix 10 μL，floR基因上、下游引物各1 μL，ddH2O6 μL，菌株DNA 2 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，63.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環;72 ℃ 終延伸10 min;4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳后，陽性PCR產物回收并送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果在NCBI網站上進行BLAST比對。

1.2.8隨機引物PCR（AP-PCR）

APP分離株的RAPD圖譜是運用AP-PCR技術確定的，以提取DNA作為模板，設計引物AP進行PCR擴增。AP-PCR的反應體系：2×PCR Taq Master Mix 10 μL，引物1 μL，菌株DNA 2 μL，ddH2O補至20 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性1 min，50 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，共40個循環;72 ℃終延伸10 min;4 ℃保存。擴增產物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳，并用生物電泳凝膠成像系統生成電泳圖后，再用GelComparⅡ 6.6軟件對此隨機引物擴增出的各菌株DNA條帶進行整合，建立系統進化樹狀圖。根據聚類結果，以APP的相似性系數進行分型，大于80%的判定為同一種RAPD型，小于80%的判定為不同的型[15]，見表1。

2結果與分析

2.1細菌的分離鑒定

2.1.1分離菌株的培養特性

分離菌株經37 ℃恒溫箱中培養18～20 h后，在巧克力色血瓊脂平板上菌落為濁白色、圓形隆起，直徑大小為1～2 mm，在TSA平板上菌落半透明、表面光滑、邊緣整齊，菌落直徑在1 mm左右（圖1），普通瓊脂培養基上不生長。

挑取典型菌落進行革蘭染色鏡檢，油鏡下可見革蘭陰性小球桿菌，菌體較小，多散在桿狀，符合APP的形態和染色特征（圖2）。

2.1.2分離菌株的生化試驗鑒定結果

生化試驗鑒定結果顯示，分離菌株均可發酵葡萄糖、蔗糖和甘露糖，但不發酵乳糖、阿拉伯糖、甘露醇和麥芽糖。尿酶試驗和過氧化氫試驗呈陽性，吲哚試驗和硫化氫試驗呈陰性。生化試驗結果與文獻上報道的APP分離株生化試驗結果相吻合。

2.1.3分離菌株的PCR鑒定結果

采用ApxⅣ毒素基因的特異性引物對分離菌株和標準菌株進行PCR擴增，均獲得預期長度（442 bp）的特異性條帶（圖3），測序結果在NCBI中進行BLAST比對，與ApxⅣ毒素基因（GenBank登錄號AX002405）的同源率達到99%以上。

2.2藥敏試驗結果

參照CLSI判定標準[14]，FFC對APP的折點為S≤2;I=4;R≥8（S表示敏感;I表示中介;R表示耐藥）。FFC質控APP的允許范圍為0.25～1.00 μg/mL，本次制備的藥物儲備液測試質控菌ATCC27090的MIC<0.5 μg/mL，均符合要求。由表2可知，4株APP對FFC耐藥，耐藥率為14.29%（4/28），MIC范圍介于≤0.5～256.0 μg/mL。

2.3floR基因檢測結果

分離鑒定的28株APP有15株攜帶floR基因，檢出率為53.57%（15/28）。由圖4可知，目的條帶位于510 bp 處，回收目的條帶測序并進行BLAST比對，結果發現與GenBank已上傳的大腸桿菌floR基因（GenBank登錄號：EF429662）同源性高達99%。將floR基因的測序結果整理后上傳到GenBank，取得的GenBank序列號為MG920811。

2.4隨機擴增多態性DNA（RAPD）

AP-PCR研究發現，28株APP共被分成A和B 2大類，由圖5可見，2類間幾乎不存在同源性。來自河南、湖北、江西、陜西、湖南、山西、安徽等7個省份的分離株核苷酸親緣差異性跨度較大，大部分菌株間的同源性為40%～80%，表明此大多數APP分離株是不同的RAPD型。其中，A類有25株，其中14株攜帶floR基因，核苷酸同源性達80%以上的菌株有6株，分別為170313-1F9、171103-1P1、171103-2F1、171103-3F3、170313-2F4和1144，該6株可分為3種RAPD型，剩下19株每株各1個RAPD型，共22種型;B類有3株，共3種RAPD型，有1株攜帶floR基因。A和B 2大類28株APP共被分為25種RAPD型。

3討論

APP是豬傳染性胸膜肺炎的特異病原菌，其可與其他病原菌繼發感染此呼吸道疾病，如巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌等，也可繼發病毒性疾病，如豬繁殖與呼吸障礙綜合征、偽狂犬病毒病等。該病原菌無明確的選擇性培養基，所以在分離鑒定時很難除去雜菌，純化難度大，導致此菌不能或很難分離[16]。APP對培養基和培養條件要求特殊，且生長緩慢，菌落含菌量少。若應用槍尖法（采用移液槍槍尖直接沾取少量細菌固體培養物于PCR管中，加PCR試劑進行反應）不利于PCR擴增。根據PCP流行病學特點，本研究主要于3—4月及9—12月集中分離病原菌并從206份病料（患豬肺臟、脾臟、支氣管等）中成功分離鑒定出28株APP。鑒定關鍵是充分運用菌液PCR檢測技術，來源于Schaller等根據ApxⅣ基因設計引物建立的方法[1]。

近年，國內集約化養殖場對抗生素的需求量越來越大，甚至長期使用抗生素治療、控制養殖場的患病豬。臨床上，細菌對抗菌藥不敏感的現象屢見不鮮，甚至出現高強度耐藥或多重耐藥，包括APP對FFC耐藥，如車勇良等分離鑒定的APP對FFC出現耐藥現象[17]等。APP對FFC的耐藥性還可能與地域有關，例如Kucerova等從分離的APP中檢測出對FFC耐藥率為0.8%，并從所有耐FFC的菌株中均檢測出floR基因[7]。王濤等報道其在蘇北地區分離鑒定的3株APP對FFC高度敏感[18]。Bossé等從耐FFC的APP中提取質粒（pM3446F）測得序列并表明含有floR基因[8]。張東超等在天津某規模豬場分離鑒定的APP臨床株中，測試其藥物敏感性試驗發現對FFC高度敏感[19]。國外也報道過APP的臨床分離株對FFC敏感[9-11]。APP對FFC耐藥最根本的原因是菌株體內floR等基因的表達導致其對FFC耐藥。

本試驗測試分離株APP對FFC的耐藥率為14.29%，但floR的檢出率（53.57%） 顯著高于APP對FFC的耐藥率?這顯然說明floR基因在部分APP體內不表達或低表達，因此導致其對FFC不能耐藥。FFC作為動物專用廣譜抗生素，本研究表明其對多數APP的抗菌活性較高，在臨床對治療APP感染仍有較高的應用價值。floR基因在國外APP中有研究報道[20-21]，但在國內APP分離株中尚未見有檢出的報道，而本研究在國內首次檢測出floR基因，floR基因在APP中的檢出應引起重視。

目前，細菌基因分型的方法主要包括隨機擴增多態性DNA（RAPD）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）、多位點序列分型（MLST）、腸桿菌基因間重復序列PCR（ERIC-PCR）和基因外重復回文序列PCR（REP-PCR）等。本研究采用的RAPD分型方法簡單易行，是由Williams等在PCR技術的基礎上首創的1種基因分型方法，運用隨機引物擴增以尋找多態性DNA片段，其擴增周期短且無放射性，可用肉眼觀察[22]。RAPD的條帶越相近，說明其核苷酸的同源性越高，親緣性越近，為克隆傳播。采用GelComparⅡ6.6軟件生成進化樹狀圖，發現此分離株共被分成幾乎不存在同源性的兩大類（A和B類）。A類被分為22種型，B類被分為3種型，共25種RAPD型。攜帶floR基因的菌株大多集中在A類，且含floR基因的菌株核苷酸同源性多在40%～80%間，表明來自不同省份分離株的核苷酸同源性差異較大，含有floR基因菌株間的核苷酸的同源性較低，說明攜帶floR基因的APP臨床分離株之間的遺傳關系較遠，多數來自不同的克隆，floR基因在試驗菌株間主要是以水平方式傳播。

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