微波輻射法提取藏藥唐古特烏頭總生物堿的工藝

李欽玲 陳玉乾

摘要：采用微波輻射提取法對(duì)藏藥唐古特烏頭中的總生物堿進(jìn)行提取，并用紫外分光光度法測(cè)定唐古特烏頭提取物中總生物堿的含量，用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，微波輻射提取唐古特烏頭中總生物堿的最佳工藝條件如下：料液比為1 g ∶15 mL，浸泡時(shí)間為2 h，提取時(shí)間為15 min，提取溫度為40 ℃。在最佳工藝條件下，提取液中的生物堿含量最高，平均提取率為1.014%，表明該提取工藝耗時(shí)短，效率高，穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：唐古特烏頭;生物堿;正交試驗(yàn)設(shè)計(jì);微波輻射法

中圖分類號(hào)： R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）21-0260-03

收稿日期：2019-04-06

基金項(xiàng)目：教育部春暉計(jì)劃（編號(hào)：2010070）。

作者簡(jiǎn)介：李欽玲（1962—），女，山西襄汾人，碩士，教授，研究方向?yàn)樘烊挥袡C(jī)化學(xué)。E-mail：qhmdlql@126.com。

藏藥唐古特烏頭[Aconitum tanguticu（Maxmi.）Stapf]為毛茛科植物，多分布在青海、甘肅甘南、四川藏區(qū)等海拔為3 200～4 200 m 的高山草地或山頂多石礫處[1]。唐古特烏頭又稱甘青烏頭，藏藥名為榜噶，具有清熱解毒、生肌收口、燥濕等功效，多用于治療肝熱、膽熱、肺熱、肝炎、肺炎、胃腸炎以及瘍瘡、蛇蝎咬傷等[2-3]。據(jù)報(bào)道，唐古特烏頭中的主要生物堿成分為毒性較小的內(nèi)酯型二萜生物堿[4-6]，具有廣泛的藥用價(jià)值。近年來，對(duì)唐古特烏頭抗病毒、抗炎作用的研究均有報(bào)道[7-9]，哈文秀等做了唐古特烏頭中多糖的提取研究[10]，但是對(duì)其生物堿提取工藝的研究少見報(bào)道。

本試驗(yàn)采用微波輻射法對(duì)藏藥唐古特烏頭干燥全草的生物堿進(jìn)行提取，用紫外分光光度法測(cè)定其含量，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)其提取工藝進(jìn)行研究，旨在獲得唐古特烏頭總生物堿的最佳提取工藝條件，在此基礎(chǔ)上建立簡(jiǎn)單快捷的檢測(cè)手段，為開發(fā)和利用特色藥物、提取和分離該種植物的有效成分提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

本試驗(yàn)所用藥材于2016年采自青海互助北山林場(chǎng)，經(jīng)青海民族大學(xué)藥學(xué)院藏藥專家毛繼組老先生鑒定為毛茛科烏頭屬植物唐古特烏頭[Aconitum tanguticu（Maxmi.）Stapf]全草;生物堿對(duì)照品，由青海民族大學(xué)藥學(xué)院中藏藥研究室提供;主要試劑為95%乙醇[分析純（AR）]、三氯甲烷（AR）、鹽酸（AR）、氨水（AR），試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2儀器設(shè)備

752N型紫外-可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）;XH-100A微波催化合成/萃取儀（北京祥鴿科技發(fā)展有限公司）;FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）;FA2204型電子分析天平（上海安亭電子儀器廠）;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;SHZ-DC（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪華儀器有限公司）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樣品的處理取干燥的唐古特烏頭全草，去雜質(zhì)、干燥、粉碎后備用。

1.3.2樣品溶液的制備及檢驗(yàn)準(zhǔn)確稱取5.00 g粉碎后的唐古特烏頭，用75 mL 95%乙醇浸泡4 h，再用微波萃取儀提取3次，每次15 min，合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇得浸膏。往浸膏內(nèi)加入2% HCl溶液使之充分溶解，減壓抽濾，重復(fù)操作2～3次。合并濾液，用濃氨水調(diào)節(jié)pH值至6～7，加活性炭脫色，用三氯甲烷萃取3次，再將pH值調(diào)至≥12，用三氯甲烷進(jìn)一步萃取3次，合并萃取液，旋蒸回收三氯甲烷，另加三氯甲烷定容至100 mL，得待測(cè)溶液。用顯色劑碘化鉍鉀檢測(cè)生物堿含量。

1.3.3樣品最大吸收波長(zhǎng)的確定取1 mL“1.3.2”節(jié)中制備好的樣品溶液，用三氯甲烷稀釋并定容至25 mL，在210～450 nm范圍內(nèi)掃描溶液的紫外吸收光譜，間隔10 nm掃描，得最大波長(zhǎng)范圍為240～300 nm，然后在此范圍內(nèi)間隔2 nm繼續(xù)掃描，測(cè)得該溶液在268 nm處有最大吸收峰，因此選擇268 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.4唐古特烏頭標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和線性關(guān)系考察

1.3.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備準(zhǔn)確稱取唐古特烏頭生物堿對(duì)照品1.545 mg，加適量三氯甲烷，微熱溶解，移入25 mL容量瓶中，冷至室溫后稀釋至刻度處，搖勻，即得濃度為0.061 8 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確量取“1.3.4.1”節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5、6 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加三氯甲烷稀釋至刻度處，搖勻，靜置。以三氯甲烷為空白對(duì)照，于268 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度（表1）。以生物堿對(duì)照品濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（D268 nm）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：D268 nm=0.060 6C-0001 1，r2=0.999 6。結(jié)果表明，生物堿對(duì)照品在2.00～15.00 μg/mL 濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.5生物堿的提取及含量測(cè)定

1.3.5.1生物堿的提取及含量測(cè)定方法準(zhǔn)確稱取1.000 g唐古特烏頭藥材粉末，用“1.3.2”節(jié)的方法進(jìn)行提取、處理，定容至50 mL容量瓶中，待測(cè)。準(zhǔn)確量取1.25 mL待測(cè)液，用三氯甲烷定容至25 mL容量瓶中，在268 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算出唐古特烏頭提取液中的生物堿含量。

1.3.5.2生物堿提取條件的優(yōu)化根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果和對(duì)各種因素的考察，以提取物中的總生物堿含量為考察指標(biāo)，以藥材浸泡時(shí)間、料液比（質(zhì)量比）、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素，采用L9（34）設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察其最佳提取條件。試驗(yàn)的因素水平設(shè)置見表2。

2結(jié)果與分析

2.1唐古特烏頭總生物堿最佳提取工藝的確定

2.1.1直觀分析由表3可知，各因素對(duì)唐古特烏頭中總生物堿提取率的影響大小順序?yàn)锳>C>B>D，即料液比>提取溫度>提取時(shí)間>浸泡時(shí)間;料液比對(duì)提取唐古特烏頭中生物堿提取率的影響較大，浸泡時(shí)間的影響較小，最佳提取工藝為A3B2C2D1，即當(dāng)料液比為1 g ∶15 mL、浸泡時(shí)間為2 h、提取溫度為40 ℃、提取時(shí)間為15 min時(shí)，提取效果最佳。

2.1.2方差分析由表4可知，A因素對(duì)提取指標(biāo)的影響顯著（P<0.05），與直觀分析結(jié)果一致。

2.2最佳提取工藝條件的驗(yàn)證

為了考察和驗(yàn)證最佳提取工藝條件的穩(wěn)定性和試驗(yàn)結(jié)果，在料液比為1 g ∶15 mL、浸泡時(shí)間為2 h、提取溫度為40 ℃、提取時(shí)間為15 min的條件下，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)。由表5可以看出，3次試驗(yàn)結(jié)果指標(biāo)均高于正交試驗(yàn)中的任何1組，藏藥唐古特烏頭中總生物堿含量為1.014%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.74%，說明篩選的最佳工藝條件穩(wěn)定可靠。

3結(jié)論

微波輔助萃取（microwave assisted extraction，簡(jiǎn)稱MAE）是利用介質(zhì)在微波作用下高速運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的熱效應(yīng)[11]，使細(xì)胞壁破裂，從而使得胞外溶劑易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，溶解并釋放胞內(nèi)產(chǎn)物，具有強(qiáng)力、瞬時(shí)、高效、耗時(shí)短等特點(diǎn)[12]。本試驗(yàn)采用微波輻射法提取唐古特烏頭中的生物堿，大大縮短了提取時(shí)間和溶劑用量，以紫外分光光度法測(cè)定其含量，并通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了藏藥唐古特烏頭中生物堿的最佳提取工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，料液比為1 g ∶15 mL、浸泡時(shí)間為2 h、提取時(shí)間為15 min、提取溫度為40 ℃時(shí)，總生物堿提取率可達(dá)1.014%，具有較高的提取效率。本研究方法用時(shí)短、效率高、穩(wěn)定性好，為唐古特烏頭中總生物堿的進(jìn)一步應(yīng)用和開發(fā)提供了一定的參考和科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄24.

[2]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì). 中華本草[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2001：307.

[3]羅達(dá)尚. 中華藏本草[M]. 北京：民族出版社，1997：65-66.

[4]王海頃，蔣山好，楊培明，等. 甘青烏頭的生物堿[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，14（4）：13-15.

[5]肖培根，王鋒鵬，高峰. 中國(guó)烏頭屬植物藥用親緣學(xué)研究[J]. 植物分類學(xué)學(xué)報(bào)，2006，44（1）：1-46.

[6]林玲，陳東林. 毛果甘青烏頭中生物堿成分的提取和鑒定[J]. 四川生理科學(xué)雜志，2009，31（2）：69-72.

[7]曾銳，侯新蓮，高宇明. 榜嘎總堿對(duì)關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎癥因子表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)中醫(yī)急癥，2009，18（3）：427-428.

[8]瞿燕. 藏藥榜嘎總生物堿的抗炎實(shí)驗(yàn)研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（10）：2412-2413.

[9]張春江，李薇，孫振鵬，等. 藏藥甘青烏頭抗單純皰疹病毒Ⅱ型體內(nèi)外作用研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2009，44（1）：26-31.

[10]哈文秀，利毛才讓. 超聲法提取藏藥唐古特烏頭中多糖的研究[J]. 化學(xué)與生物工程，2010，27（7）：63-65.

[11]謝正禮，徐世榮，吳云鵬. 微波輔助萃取技術(shù)及其在中草藥研究中的應(yīng)用[J]. 中成藥，2005，27（11）：1326-1329.

[12]劉婷婷，郁穎佳，段更利，等. 離子液體-微波輔助提取鉤藤中生物堿的工藝研究[J]. 中國(guó)新藥與臨床雜志，2013，32（6）：482-486.