干細(xì)胞移植后示蹤技術(shù)的研究進(jìn)展

劉志燕 龍瀛 何曉曉 周曉

【提要】 干細(xì)胞具有再生和分化的能力，干細(xì)胞移植已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用于疾病的治療。在干細(xì)胞移植的實(shí)驗(yàn)研究中，需要對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，來(lái)觀察和追蹤其在宿主內(nèi)的分布和增殖等情況。目前，干細(xì)胞標(biāo)記主要分為直接標(biāo)記和間接標(biāo)記。直接標(biāo)記即將標(biāo)記試劑直接引入到干細(xì)胞中，間接標(biāo)記是將報(bào)告基因整合到細(xì)胞中，繼而檢測(cè)基因表達(dá)產(chǎn)物。本文對(duì)現(xiàn)有的干細(xì)胞示蹤技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)和研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

干細(xì)胞是指能夠自我更新并分化為不同類型細(xì)胞的未分化細(xì)胞，依據(jù)其來(lái)源可分為兩種類型：胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。由于干細(xì)胞具有分化為特定細(xì)胞的能力，已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用于各類疾病的治療，如肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、視網(wǎng)膜疾病和新生兒顱腦損傷等，取得了重大進(jìn)展[1-5]。干細(xì)胞在移植后可以遷移到損傷和病變的部位，然后分化為靶細(xì)胞并定植于損傷部位，發(fā)揮治療作用[6]。

在干細(xì)胞研究中，需要通過(guò)標(biāo)記干細(xì)胞，以觀察和追蹤其在宿主體內(nèi)的遷移、分布、增殖和分化等情況。目前，有兩種細(xì)胞示蹤技術(shù)應(yīng)用于干細(xì)胞療法，一種是用分子探針直接標(biāo)記細(xì)胞，另一種是用報(bào)告基因間接標(biāo)記細(xì)胞[7-8]。為了更好地了解干細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)行為，選擇合適的示蹤技術(shù)至關(guān)重要。本文比較各種示蹤技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)目前干細(xì)胞示蹤技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 直接標(biāo)記

在干細(xì)胞標(biāo)記中使用最多的就是直接標(biāo)記，即將標(biāo)記試劑引入到移植的細(xì)胞中。直接標(biāo)記不會(huì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，具有安全可靠的優(yōu)點(diǎn)。但是，隨著細(xì)胞的分裂，每個(gè)細(xì)胞中的標(biāo)記物會(huì)逐漸減少或消失，從而影響干細(xì)胞的示蹤。

1.1 磁共振對(duì)比劑標(biāo)記

此方法是移植前用MR對(duì)比劑標(biāo)記移植細(xì)胞，然后利用磁共振成像（MRI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行追蹤。MRI具有較高的時(shí)間和空間分辨率，且無(wú)放射性損害，使其逐漸成為活體細(xì)胞示蹤的研究熱點(diǎn)[9-10]。磁共振示蹤劑的種類較多，包括氧化鐵顆粒、順磁性物質(zhì)和19F等。

氧化鐵顆粒依據(jù)顆粒大小又分為：超順磁氧化鐵顆粒（SPIO，直徑 50～200 nm），超小超順磁氧化鐵（USPIO，直徑 35 nm）和微米順磁氧化鐵納米粒子 （MPIO，直徑約1 μm）[11]。MPIO含鐵量最高，最敏感，但因其不能被生物降解、長(zhǎng)期存留在體內(nèi)而限制了其在研究和臨床中的應(yīng)用[12]。SPIO標(biāo)記細(xì)胞后與血紅蛋白結(jié)合或參與其他代謝過(guò)程，能被生物降解，是目前為止唯一被用于臨床的對(duì)比劑[13]。由于細(xì)胞膜表面和未修飾的SPIO均帶負(fù)電荷，使SPIO顆粒難以被細(xì)胞攝入，需要在SPIO表面修飾轉(zhuǎn)染試劑來(lái)提高標(biāo)記效率。Horak等[14]發(fā)現(xiàn)，與沒(méi)有修飾的SPIO相比，兔BMSC對(duì)表面修飾D-甘露糖的SPIO顆粒攝取量明顯提高，且細(xì)胞功能、活性和增殖能力均未受影響。此外，用多聚賴氨酸表面修飾的SPIO標(biāo)記人間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)修飾后的SPIO攝取率達(dá)92%，并在大腦病變區(qū)通過(guò)MRI示蹤到了移植的干細(xì)胞[15]。Karussis等[16]用SPIO標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞后移植到多發(fā)性硬化癥和脊髓側(cè)索硬化癥患者體內(nèi)，用MRI觀察到細(xì)胞的分布和分化，且未發(fā)現(xiàn)SPIO導(dǎo)致的細(xì)胞病理改變，說(shuō)明SPIO在臨床上是安全可行的。但是，SPIO作為示蹤劑也存在不足：①靈敏度較低；②SPIO濃度隨著細(xì)胞分裂而逐漸稀釋；③標(biāo)記細(xì)胞死亡后釋放的SPIO被其他細(xì)胞吞噬，造成假陽(yáng)性[17]；④SPIO的標(biāo)記效率與用量有關(guān)，但高劑量的SPIO會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力降低[18]。

用于MRI對(duì)比劑的順磁性物質(zhì)主要有釓 （Gd3+）和錳（Mn2+）兩類，但是Gd3+和Mn2+都有細(xì)胞毒性，限制了其在生物體內(nèi)的應(yīng)用。Gd2O3@MCM-41是一種釓的新型對(duì)比劑，與Gd3+相比，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，且對(duì)細(xì)胞分化影響小。Shen等[19]用Gd2O3@MCM-41標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞移植小鼠體內(nèi)后，用MRI追蹤了14 d。

19F作為對(duì)比劑敏感度高，且信號(hào)強(qiáng)度與19F的量成正比，故可用于量化標(biāo)記的細(xì)胞[20]。Helfer等[21]的研究表明，用19F標(biāo)記鼠BMSC會(huì)造成細(xì)胞活力的一過(guò)性降低，但很快恢復(fù)正常，并觀察到BMSC在脾臟內(nèi)發(fā)育成正常的集落形成單位，說(shuō)明標(biāo)記了19F的BMSC仍具有分化治療作用。但是19F對(duì)細(xì)胞毒性的影響不明，還需要進(jìn)一步的研究。

1.2 熒光標(biāo)記

1.2.1 熒光染料的非特異性標(biāo)記

不同的熒光染料可以與干細(xì)胞的細(xì)胞膜或細(xì)胞核等不同部位可逆或不可逆地結(jié)合，然后通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察干細(xì)胞的遷徙和存活等情況。目前已有多種熒光染料被用于標(biāo)記干細(xì)胞。

Dil是一種親脂性碳花青染料，因?yàn)槟軌蚯度爰?xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層內(nèi)做側(cè)向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，所以可以標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞膜。Dil對(duì)活體細(xì)胞沒(méi)有毒性，不會(huì)從標(biāo)記的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到未被標(biāo)記的細(xì)胞，且熒光衰減率低，可用于觀察細(xì)胞遷移和分化情況[22]。韓明子等[23]成功將Dil標(biāo)記小鼠骨髓細(xì)胞，并在肝臟中檢測(cè)到熒光，證明其來(lái)源于骨髓細(xì)胞。雖然Dil的細(xì)胞毒性低，但是會(huì)影響早期的細(xì)胞增殖，傳代后細(xì)胞內(nèi)的熒光會(huì)衰減，也不利于干細(xì)胞的長(zhǎng)期示蹤，只能用于細(xì)胞短期示蹤[24]。

Hoechst是一種雙苯酰亞胺類核熒光染料，細(xì)胞通透性高，可與細(xì)胞核內(nèi)雙鏈DNA的堿基牢固結(jié)合，在紫外線激發(fā)下，能發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光。Hoechst的標(biāo)記率高，保存時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞毒性低。Lee等[25]將Hoechst標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)4周后，仍能觀察到標(biāo)記細(xì)胞。

在最近報(bào)道的熒光材料中，聚集誘導(dǎo)的發(fā)光熒光素（AIEgens）引起了生物學(xué)領(lǐng)域越來(lái)越多的研究興趣[26-28]。與常規(guī)有機(jī)染料不同，AIEgens是具有旋轉(zhuǎn)單元的螺旋槳形分子，由于分子運(yùn)動(dòng)的限制，只有在聚集形態(tài)時(shí)才能強(qiáng)烈發(fā)射[29-30]。AIEgen構(gòu)建的生物探針，具有低背景干擾、高靈敏度和優(yōu)異的耐光漂白性等優(yōu)點(diǎn)。Yang等[31]將AIE粒子標(biāo)記脂肪干細(xì)胞后植入小鼠放射性皮膚損傷部位，發(fā)現(xiàn)其能穩(wěn)定追蹤ADSC，并且不影響ADSC的治療作用。

1.2.2 熒光染料的特異性標(biāo)記

熒光染料的特異性標(biāo)記即Y染色體標(biāo)記。雄性物種與雌性物種相比，含有特殊的Y染色體。通過(guò)對(duì)Y染色體的長(zhǎng)臂末端含有的一段重復(fù)序列進(jìn)行熒光原位雜交，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行示蹤，具有技術(shù)簡(jiǎn)單、標(biāo)記效率高等優(yōu)點(diǎn)，并且時(shí)間、組織類型和細(xì)胞表型的變化對(duì)標(biāo)記沒(méi)有影響[32]。Crain等[33]報(bào)道了將男性親屬的BMSC移植給女性患者后，對(duì)患者腦組織進(jìn)行切片，檢測(cè)到了含有Y染色體的神經(jīng)細(xì)胞，說(shuō)明BMSC能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞。Dalakas等[34]將男性BMSC移植到女性酒精性肝病患者體內(nèi)，用FISH成功檢測(cè)到Y(jié)染色體，證實(shí)了BMSC有向肝肌成纖維細(xì)胞分化的能力。然而，Y染色體標(biāo)記的缺點(diǎn)是不能用于自體移植和女性供體時(shí)的示蹤。

1.2.3 熒光納米材料標(biāo)記

量子點(diǎn)（QDs）是由硒化鎘制成的半導(dǎo)體熒光納米材料，具有寬的激發(fā)波長(zhǎng)、窄的發(fā)光譜和強(qiáng)的發(fā)光性能等，已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用于活細(xì)胞的標(biāo)記[35]。但是，量子點(diǎn)因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)特點(diǎn)而難以通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散的方式快速穿過(guò)細(xì)胞膜，故需通過(guò)吞噬、肽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)和受體介導(dǎo)的內(nèi)化等方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[36-38]。Shah等[39]將多肽RGD偶聯(lián)的QDs與間充質(zhì)干細(xì)胞一起培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞吞噬QDs后仍保持增殖和分化的特性。Lei等[40]將多肽Tat連接在聚乙二醇包被的QDs后標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞，然后將標(biāo)記了的干細(xì)胞注射到小鼠尾部，最后在肝、脾和肺部都觀察到了熒光。Rosen等[41]用DQs標(biāo)記的干細(xì)胞在心臟中維持了至少8周。這些研究表明，QDs可以作為探針標(biāo)記自我更新和分化的干細(xì)胞，并且QDs在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞形態(tài)和增殖沒(méi)有影響，也不影響細(xì)胞的正常生理代謝，可用于細(xì)胞的長(zhǎng)期示蹤[42]。然而，由于大多數(shù)量子點(diǎn)有鎘離子，在高濃度時(shí)對(duì)標(biāo)記細(xì)胞有生理毒性，影響標(biāo)記細(xì)胞的增殖[43]。

2 間接標(biāo)記

間接標(biāo)記又可分為報(bào)告基因標(biāo)記和核酸標(biāo)記，即將DNA序列或核酸類似物整合到細(xì)胞基因組中，繼而編碼能夠產(chǎn)生對(duì)比的蛋白質(zhì)或通過(guò)抗原抗體反應(yīng)追蹤干細(xì)胞。使用這種標(biāo)記技術(shù)，信號(hào)不會(huì)隨著細(xì)胞分裂而丟失，因?yàn)閳?bào)告基因能與基因組基因一起復(fù)制，并且強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，所以也有利于細(xì)胞計(jì)數(shù)[44]。

2.1 報(bào)告基因標(biāo)記

Liang等[45]將PRE9基因作為報(bào)告基因標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞后移植到免疫缺陷小鼠腦內(nèi)，并進(jìn)行體內(nèi)和體外發(fā)光鑒定，發(fā)現(xiàn)PRE9在620 nm處穩(wěn)定發(fā)光，并且發(fā)射峰不受pH值影響，受組織吸光度的影響也很小。

1962年，Shimomura等[46]在水母體內(nèi)分離出了一種由238個(gè)氨基酸組成的單體蛋白質(zhì)，因?yàn)槟茉跓晒怙@微鏡下吸收400 mm的藍(lán)光并發(fā)出508 mm的綠色熒光，所以命名為綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）。 隨后，不同波長(zhǎng)的熒光蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)，包括黃色熒光蛋白（Yellow fluorescent protein，YFP）、藍(lán)色熒光蛋白（Blue fluorescent protein，BFP）和紅色熒光蛋白（Red fluorescent protein，RFP）等。 熒光蛋白基因通過(guò)病毒和質(zhì)粒等載體與目的蛋白基因整合后，可以在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并在激發(fā)光照射下發(fā)出熒光。GFP對(duì)細(xì)胞的毒性作用和不良反應(yīng)較小，細(xì)胞活力和完整性幾乎不受影響[47]。但野生型的GFP在發(fā)光強(qiáng)度和靈敏度方面較差[48]，目前使用較多的是人工突變體增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP），EGFP 增強(qiáng)了 GFP 的熒光性能，改善了GFP的熱穩(wěn)定性，有較好的發(fā)光強(qiáng)度和靈敏度。Pinero等[49]用EGFP標(biāo)記了BMSC，研究其對(duì)坐骨神經(jīng)髓鞘再生的作用，觀察到了至少持續(xù)60 d的熒光穩(wěn)定表達(dá)。

但是，由于宿主基因?qū)ν庠磮?bào)告基因的沉默，報(bào)告基因可能在傳代后表達(dá)減少，這種情況在逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染干細(xì)胞時(shí)尤為常見(jiàn)[50]。整合載體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾還存在許多潛在的安全問(wèn)題，更重要的是有可能激活附近的原癌基因，將想要標(biāo)記的治療細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞[51-52]。因此，間接成像技術(shù)通常僅在終末期患者中使用[53]。

2.2 核酸標(biāo)記

溴脫氧尿嘧啶（BrdU）是一種嘧啶類似物，是最具代表性的核酸標(biāo)記物。BrdU在DNA復(fù)制時(shí)，可以與胸腺嘧啶競(jìng)爭(zhēng)，加入到DNA的核酸序列中。BrdU被用來(lái)標(biāo)記增殖期細(xì)胞，通過(guò)定量評(píng)估細(xì)胞合成DNA的水平，可以量化標(biāo)記細(xì)胞。馬曉菁等[54]用BrdU成功標(biāo)記了骨髓干細(xì)胞，在大鼠創(chuàng)面觀察到了陽(yáng)性細(xì)胞的聚集。BrdU標(biāo)記簡(jiǎn)單易行，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，但是BrdU需要DNA變性后才能與抗體結(jié)合，常導(dǎo)致染色彌散，移植了BrdU的細(xì)胞死亡后也會(huì)將其釋放出來(lái)污染鄰近細(xì)胞，出現(xiàn)假陽(yáng)性[55]。5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）是另外一種胸腺嘧啶核苷類似物，無(wú)需DNA變性即可檢測(cè)，但EdU能降低干細(xì)胞的活力，損害細(xì)胞表型，應(yīng)該避免EdU標(biāo)記用于干細(xì)胞示蹤[56]。

盧榮等[57]用 Hoechst 33342、BrdU、GFP三種方法標(biāo)記皮膚干細(xì)胞，結(jié)果顯示三種物質(zhì)對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性作用。其中，Hoechst 33342的標(biāo)記率最高，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)熒光逐漸衰減；GFP標(biāo)記最穩(wěn)定，但標(biāo)記率低；BrdU標(biāo)記細(xì)胞較穩(wěn)定，標(biāo)記率也較高。

綜上所述，目前干細(xì)胞示蹤方法眾多，每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，我們需要根據(jù)不同的細(xì)胞情況或?qū)嶒?yàn)類型選擇最適宜的標(biāo)記方法，以達(dá)到最好的示蹤效果。理想的示蹤方法應(yīng)該具有簡(jiǎn)單易行、特異性強(qiáng)、靈敏度高、細(xì)胞毒性低、受外界干擾小以及移植干細(xì)胞的長(zhǎng)期定量等優(yōu)點(diǎn)。隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，干細(xì)胞示蹤技術(shù)也將得到不斷發(fā)展。