脂肪干細胞促進脂肪移植血管化的研究進展

尹鈺佳 顧婕妤 李東 袁捷

【提要】 自體脂肪移植時，其組織基質血管片段（Stromal vascular fraction，SVF）中存在脂肪干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSC），具有強大的促血管化作用。本文對近年來有關ADSC促進脂肪移植血管化的研究進展進行綜述，以期為ADSC促血管化作用在脂肪移植領域的應用提供新方向。

自體脂肪移植已廣泛應用于先天畸形、外傷、腫瘤術后等造成的軟組織缺損的修復，脂肪組織工程技術也受到缺血性疾病、糖尿病、肥胖等多疾病領域的關注。但是，脂肪組織具有特殊的組織結構和血供系統，移植后因血供不足而導致成活率低下，是一直備受關注的問題。成熟脂肪組織中僅有10%單房脂肪細胞如“葡萄串”樣排列于血管支架上，卻占據了90%的空間體積，其耗能高，血供要求高，而移植早期脂肪組織僅靠浸潤和滲透維持營養供應[1-2]。因此，移植后所處微環境的血管化程度與移植脂肪成活率息息相關。ADSC被認為是一類來源于脂肪組織中血管基質成分的間充質干細胞，具有自我更新、多種分化潛能和強大的旁分泌功能。ADSC在脂肪移植中具有突出的促血管化作用，已被廣泛應用于組織工程及臨床各個領域。大量研究表明，脂肪移植前的預處理及脂肪移植中ADSC發揮的作用，均能有效促進血管化的程度，從而提高脂肪移植物存活率。本文對預處理及ADSC的促血管化作用的研究進展進行綜述。

1 脂肪移植促血管化預處理

利用移植ADSC進行組織修復過程中，由于血管化程度不足或處于低氧環境，所得的脂肪體積常遠小于移植物。然而，在脂肪移植前進行有效預處理可促進ADSC成血管化過程，提高移植成活率。就組織工程研究而言，在確定了種子細胞為ADSC的前提下，合適的三維支架和ADSC生長的微環境已經成為了ADSC移植預處理的主要方向。其中，微環境的改善可以通過聯合其他細胞共培養、額外添加的生長因子和血小板、缺氧環境的改善以及一些物理手段等途徑達到。

1.1 支架材料

支架材料可分為天然材料、人工合成材料以及脫細胞脂肪組織基質。良好的支架材料通常具有高表面積/體積比，有助于細胞的黏附、增殖、遷移和分化。脫細胞化生物支架去除了免疫組分細胞外基質，優點在于保留了天然的細胞增殖分化的微環境。同時，脫細胞脂肪組織基質經不同脫細胞方法獲得后，組織特異性與誘導ADSC成脂分化的能力不變[3]。Duisit等[4]應用SDS/極性溶劑法進行灌注脫細胞并移植帶血管蒂的人耳，獲得良好的耐受性和抗炎性，證明了灌注脫細胞方法在組織移植方面的實際應用價值。

1.2 聯合內皮細胞培養

人脂肪源性微血管內皮細胞 （Human adipose microvascular endothelial cells，HAMEC）和間充質干細胞（MSC）都已被證明具有血管生成能力。Pedersen等[5]將血管內皮細胞（Endothelial cells，EC）、MSC 與支架結合，以確保移植后的組織具有充分的氧氣及高度血管化。Shandalov等[6-8]基于構建帶有自身蒂的厚血管化組織的前期研究，在多孔生物降解聚合物中共同培養HAMEC和MSC作為移植體植入大鼠股骨血管周圍，形成高血管化皮瓣，以治療大面積全層軟組織缺損。

1.3 生長因子

脂肪組織中各種細胞通過旁分泌多種細胞因子，如VEGF、bFGF、EGF、IGF-1、HGF、PDGF 等，促進移植脂肪的血管化。有研究對ADSC進行基因修飾，使其過表達VEGF，或在缺氧條件下預培養ADSC以誘導產生血管生成表型[9-10]。另外，在含 4種血管生成生長因子 （EGF、FGF-2、IGF-1和VEGF）的內皮生長培養基（EGM-2）中預培養ADSC的效果優于普通的內皮培養基或添加單種生長因子的培養基[11]。

1.4 血小板

血小板內含有大量的細胞因子、生長因子和信號分子，可在損傷部位釋放，并促進組織修復、血管再生和分化。此外，血小板形成的纖維蛋白，即富含血小板的纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）也可以成為 ECs生長的支架[12]。 因此，血小板的濃縮，如富含血小板的血漿（Platelet-rich plasma，PRP）和血小板裂解液，可提供更多的生長因子來達到治療效果[13]。PRF可自然形成纖維蛋白支架，含有高濃度的白細胞，同時具有促進傷口愈合和防止感染的作用[14]。然而，ADSC的細胞活力和成脂分化能力與添加的血小板濃度密切相關，10%～20%的PRP起促進作用，而大于20%濃度的PRP則起抑制作用。此外，PRP的副產品缺乏血小板的血漿（Plateletpoor plasma，PPP）也能用于 ADSC 的擴增[15]。

1.5 缺氧環境

正常氧培養條件（21%氧）下的ADSC生長潛能低下，可能與ADSC生存條件（2%～8%氧）或體內缺血損傷所致氧化應激條件在氧合水平上的差異有關。缺氧預處理（2%氧）可以提高ADSC的生物活性和組織再生潛能，促進細胞增殖、遷移、血管生成，減少衰老和凋亡[16-17]，其機制可能與其促進血管生成和神經保護有關[18]。不同氧濃度對血管生長的影響不同，對不同成熟度的血管也會有不同影響。低氧抑制新生血管生長，卻不影響成熟血管繼續生長[19]。

1.6 其他

一些物理手段也可以作為ADSC移植的預處理方式。Yin等[20]證明體外沖擊波聯合ADSC的抗炎和促血管作用可以治療股四頭肌急性缺血再灌注損傷。Constantin等[21]利用CO2激光預照射ADSC增加其潛能。低水平光治療，尤其是紅光也可以提高ADSC的促血管化能力[22]。

2 ADSC在脂肪移植中成血管作用機制

2.1 ADSC通過分化作用促進血管網形成和穩定

ADSC作為間充質干細胞具有多能性，通過分化成為軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等發揮作用，甚至可分化成為心肌細胞作用于心肌梗死小鼠模型恢復其部分心肌功能，增加左心室射血分數[23]。ADSC可直接或經自分泌和旁分泌作用間接分化成內皮細胞、平滑肌細胞、周細胞促進血管網的形成和穩定，提高脂肪移植成活率。體外培養基通過誘導ADSC向EC表型分化聯合脂肪吸取物共同進行體內脂肪移植培養證實，EC聯合培養較協同SVF片段移植具有更高的脂肪移植存活率、移植物形態完整性和更豐富的內皮細胞標志物CD31和vWF的表達[24]。

三種分化細胞間可通過信號通路互動調節，參與血管網的構建和穩定[25]：①內皮細胞通過TβR/ALK-1和TβR/ALK-5通路調節細胞增殖和分化，同時激活潛在TGF-β，促進壁細胞（血管平滑肌細胞和周細胞）分化；②壁細胞經Ang-1/Tie2通路促進內皮細胞穩定；③毛細血管出芽時內皮細胞遷移的頂端細胞合成并分泌PDGF-B同壁細胞上PDGFR-β結合，促進周細胞的增殖和遷移；④內皮細胞S1P/S1P1信號通路有利于召集壁細胞，促進血管穩定；⑤內皮細胞和壁細胞可通過不同的Notch信號通路形成各自的動靜脈特性。

但Yuan等[26]提出，ADSC早期成血管化主要依賴分泌作用產生各種成血管因子，而不是其分化作用產生各具功能的細胞。一系列心肌梗死模型ADSC作用機制探查試驗顯示，ADSC以其旁分泌作用釋放的細胞因子為重點達到保護心肌、血管化重構、治療缺血性疾病的目的[27]。在ADSC和EC聯合培養的3D模型中，兩種細胞皆表達Wnt配體，且血管生成也受經典Wnt途徑調節。β-連環蛋白在兩種細胞內積累后完成核轉位，這種核轉位提高了核輔因子Lef-1和細胞周期蛋白D1的表達，同時也促進VEGF-A、bFGF、IGF-1等相關血管生成調節因子完成轉錄，Wnt途徑由此調節以ADSCs介導的旁分泌信號[28]。

2.2 ADSC通過自分泌和旁分泌作用調控血管化過程

2.2.1 VEGF和ADSC

在脂肪移植中，VEGF在調節血管生成和淋巴管生成方面有決定性作用。在ADSC移植后的第7天，VEGF分泌顯著增加，之后逐漸下降[29]。在缺氧情況下，VEGF分泌增加，同時其可誘導ADSC分化為內皮細胞，該途徑受到受體酪氨酸激酶（RTKs）活性的影響[29-31]。

VEGF 家族包括 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及胎盤生長因子，其中VEGF-A是主要的促血管生成因子，在促進移植物血管新生的初期作用最強。VEGF-A可與兩種受體結合，即 VEGFR-1（Flt-1）和 VEGFR-2（KDR/Flk-1），并影響內皮細胞存活、增殖、遷移、分泌和調節血管滲透性[32-33]。VEGFR-2對促血管生成的信號可以產生很強的RTKs活性，而可溶的VEGFR-1（sFlt-1）卻是一種內源性VEGF抑制因子[33]。雖然VEGFR屬于PDGFR超基因家族，但不同于PDGFR家族的下游信號通路 PI3K-Akt，VEGFR主要利用 PLCγ-PKC-MAPK通路傳遞信號。除了直接調節其下游信號通路，VEGF-VEGFR還與其他血管生成調節系統協同調節血管生成，如 Ang-Tie和Delta（DLL4）-Notch 系統[33-34]。 而在缺血情況下，VEGFR-2/mTOR/Akt途徑可被激活，此時mTOR和Akt經磷酸化可作為VEGF/VEGFR-2的下游靶標[35]。在糖尿病缺血性皮瓣成活率的研究中，HIF-1α/VEGF通路也作為缺血缺氧環境下重要的調節機制被廣泛關注[36]。

2.2.2 bFGF與ADSC

bFGF通過調節RTKs的活性，可參與到ADSC分化為內皮細胞的誘導過程[29]，同時bFGF具有促進血管樣結構形成的能力。Khan等[31]使用FGF受體阻斷劑PD173074后，抑制了其在mRNA和蛋白質水平對于內皮型一氧化氮合酶（eNOS）的誘導激活作用，同時也使毛細管柱狀結構的形成能力受到抑制。Hoseini等[37]將編碼FGF-1的質粒轉染到ADSC中進行移植培養，證明FGF-1具有促進脂肪移植中血管增殖和管形成的作用。另外，FGF過表達也可促進基質金屬蛋白酶 1（MMP-1）介導的內皮細胞遷移[38]。

2.2.3 HGF與ADSC

HGF是一種特異的促內皮生長因子，主要由成纖維細胞分泌，具有促進內皮細胞分裂增殖，抑制凋亡的作用[39]。抑制ADSC中HGF的表達降低了內皮祖細胞和成熟內皮細胞的增殖和遷移過程，導致缺血組織的血管再生受到抑制[40]。HGF促進ADSC成血管化可能主要通過HGF/c-MET通路，增加細胞外基質中FGF-2的含量。在腫瘤生成的過程中，HGF/c-MET通路可介導VEGF靶向制劑拮抗作用并通過促血管化作用促進腫瘤生長[41-42]。早期研究發現，HGF可促進基質中FGF-2的釋放，但不參與誘導FGF-2表達的過程[43]。近期Ding等[39]發現，腫瘤相關成纖維細胞產生的HGF可通過PI3K/AKT和ERK1/2信號通路促進腫瘤發生、血管生成擬態和嵌合血管的形成。

2.2.4 PDGFs與ADSC

PDGFs是由 PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D 等 4種配體構成的二聚體，在腫瘤生長、血管形成、胚胎發育和調節細胞遷移增殖等方面有重要作用。研究發現，僅有PDGFA、PDGF-C、PDGF-D、PDGF 受體 （PDGFRα 和 PDGFRβ）在ADSCs 中被表達[44]。

隨著ADSC向脂肪譜系分化，PDGFRα表達下調，而PDGFRβ在促進ADSC成血管化過程中占據重要地位。PDGFRβ可抑制白色脂肪細胞分化，還可促進ASDC增殖、遷移、血管化，并增加其旁分泌作用[45]。此外，PDGF-A與ADSC上的PDGFRα結合后，通過 PI3K/AKT/eNOS途徑，促進血管化，并促進傷口愈合[46]。內源性的PDGF-D通過線粒體電子傳遞系統產生ROS，并在體內調節ASDC的自分泌環，比PDGF-B具有更強的促有絲分裂作用[45]。

Lopatina等[47]的體外實驗證明，PDGF還可促進HAMEC分泌細胞外囊泡，囊泡內攜帶c-kit和干細胞因子（SCF），MMP含量增加，可促進血管樣結構的形成。

2.2.5 IGF-1與ADSC

IGF-1可由多種細胞產生，如血管平滑肌細胞、巨噬細胞、血小板等，在脂肪移植促進血管生成過程中，IGF-1主要發揮抗凋亡作用，并促進血管平滑肌細胞遷移。總結Lin等[48]研究可得出以下觀點：①IGF-1可以促進微血管生成，上調內皮細胞中血管生成相關基因和蛋白質表達，如VEGF-A、TGF-β、FGF-1、α-SMA、MMP-2 和 MMP-9 的表達水平上調，同時也上調ADSCs中周細胞相關基因和蛋白質表達；②內皮細胞和ADSCs共同培養，可以增強IGF-1的促血管生成作用；③IGF-1與其相應的受體結合后，激活PI3K/Akt信號傳導途徑，并進一步誘導細胞增殖、分化和遷移。但Balaji等[49]研究卻發現，IGF-1可能不會引起VEGF的直接上調，而是以其他方式影響血管生成過程，包括通過激活VEGF-2R和CD-147。此外，Haleagrahara等[50]在缺血性心肌應用領域的研究證實，IGF-1可以增加血管生成因子IL-8的表達和促進毛細血管發芽，增加心肌新生血管，從而保護缺血心肌。

2.2.6 Ang-1與ADSC

Ang-1是一種寡聚體分泌的糖蛋白，屬于血管特異性生長因子，是促進血管生成和新生血管成熟的必要條件。脂肪移植中，Ang-1與酪氨酸激酶受體Tie-2結合后受體磷酸化，并激活多種信號傳導途徑，促進血管生成和內皮細胞增殖，維持血管靜止和調節血管通透性；此外，Tie-2激活后還可以通過Akt通路激活eNOS，通過釋放一氧化氮誘導小動脈舒張，調節血管阻力。當eNOS被抑制后，MAT.Ang-1可以改善血管通透性和組織灌注，并通過VE-鈣黏蛋白起到穩定內皮屏障功能的作用[51]。

2.2.7 TGF-β與 ADSC

TGF-β在調節ADSC成血管化過程中起到雙重作用。TGF-β調節內皮細胞的功能，對內皮細胞產生兩種不同效應主要是通過兩種信號傳導途徑間的平衡介導的：ALK1和ALK5。它們各自激活不同的下游Smad途徑：①表達Smad1/5的ECs通過特異性TβR/ALK-1信號通路促進Ecs增殖和遷移；②相反，普遍表達Smad2/3的Ecs通過TβR/ALK-5信號通路則產生抑制的結果[32]。

2.2.8 SDF-1與ADSC

基質細胞衍生因子-1（SDF-1），也稱為CXCL12，被認為是不同干細胞募集和遷移過程中最重要的趨化因子。ADSC衍生的SDF-1a在血管生成中具有至關重要的作用，主要由SDF-1/CXCR4軸和SDF-1/CXCR7軸介導。其中SDF-1/CXCR7的結合是ADSC增殖所必需的，而CXCR7也是SDF-1誘導的ADSC遷移所必需的，SDF-1/CXCR4軸卻相對更多地參與調節ADSC的運動性，其中CXCR4是ADSC歸巢的重要受體[52-53]。Xu等[54]通過向人乳腺脂肪來源的干細胞（HBASC）轉染SDF-1的受體CXCR4證實，轉染后ADSC募集內皮細胞的能力增強，移植物的血運重建加快，從而促進血管化，減少脂肪細胞凋亡。

2.2.9 MMPs與ADSC

MMPs可協助ADSCs通過重塑細胞外基質，調節血管生成。Song等[55]發現，將ADSC包埋在Ⅰ型膠原蛋白組成的3D水凝膠中并預培養7 d后，接種于頂部的單層人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）大量侵入水凝膠，證實MMPs通過水解基質蛋白并使基質重塑，起到促進血管發芽的作用。其中，MMP-1可以降解Ⅰ型纖維膠原蛋白；MMP-2可以暴露膠原中促血管生成整合素的隱蔽結合位點，并激活促血管生成因子，包括TGF-β；MMP-9可以降解基底膜和其他細胞外基質組分。除了分泌型MMPs，ADSC表達的MT-MMPs在促血管化中也起到重要作用。

2.2.10 瘦素與ADSC

脂肪組織不僅可以儲存脂肪，還可以分泌瘦素、脂聯素等內分泌激素。瘦素（Leptin）是一種循環激素，通過下丘腦對飽腹感和能量消耗的反饋來調節脂肪組織的質量。有研究顯示，瘦素能調節血管通透性，并通過上調FGF-2和VEGF促進脂肪組織血管化[56]。Delle Monache等[57]提出，缺氧誘導后的ADSC中瘦素表達明顯增加，并激活HIF-2α，上調Flt-1和Tie-1等促血管生成受體。

2.2.11 其他

膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）屬于轉化生長因子β超家族，對多種神經損傷具有潛在的神經保護作用。脂肪移植中，ADSC可分泌大量GNDF，通過Ret-1特異性受體傳遞到下游的信號通路，誘導信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）的磷酸化，而STAT3在血管生成中起關鍵作用，此信號通路不依賴VEGF通路而產生促血管生成作用[58]。乳腺癌脂肪移植術后復發模型分析認為ADSC可分泌CXCL1/8，通過CXCR1/2信號通路促進HUVEC的遷移和管形成[59]。ADSC還通過產生CCL-20經COX2-PGE2軸產生抗炎、促新生血管形成和上皮重建的作用[60]。

2.3 ADSC通過釋放囊泡/外泌體介導血管化信號傳導通路

囊泡/外泌體是由細胞釋放和質膜包被的小泡，通過裝載攜帶RNAs、蛋白和脂質等，引發受體細胞下游信號通路，參與相鄰或遠距離細胞間的信息交流。研究表明，ADSC除去分化和分泌細胞因子的作用外，還可通過分泌囊泡/外泌體參與到血管化的信號傳遞通路中，從而促進內皮細胞增殖、遷移和管形成[61]：①促內皮細胞分化培養基預處理的ADSC囊泡數量顯著上調，其通過攜帶miR-31作用于血管內皮細胞FIH1促進人HUVEC遷移和管形成，小鼠動脈環的微血管生長[62]；②ADSC外泌體攜帶miR-125a作用于內皮細胞，抑制DLL4（一種血管化抑制因子）以促進內皮細胞頂端細胞的構成介導血管化[63]；③應用高表達MiR-126的ADSC外泌體可顯著促進心肌缺血性損傷微血管的形成和遷移，同時通過抑制凋亡、抗炎、抗纖溶作用保護心肌細胞[64]；④富含microRNA-181b-5p的ADSCs外泌體于缺氧缺葡萄糖的環境下抑制大腦微血管內皮細胞TRPM7的表達，增加HIF-1和VEGF的表達，下調MMP-3組織抑制劑的表達，促進內皮細胞遷移和管形成，治療腦卒中[65]；⑤富含長段非編碼RNA（lncRNA）MALAT1（Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1）的外泌體通過增加FGF-2和bFGF表達，促進人表皮成纖維細胞遷移和血管化，有利于創傷愈合[66]；⑥缺氧誘導下的囊泡可通過VEGF/VEGF-R通路促進血管化[67]等。

3 ADSC在脂肪移植中促血管化作用的應用

ADSC具有來源豐富、微創、易獲取、易擴展、免疫原性低、體外增值能力強、不存在倫理問題限制等優點，使其在骨骼和肌肉系統疾病、慢性損傷的修復、心血管系統疾病、泌尿系統疾病、自身免疫性疾病（如關節炎、結腸炎、自身免疫性糖尿病）等的治療方面具有廣泛的應用前景，但ADSC應用于臨床還需要進行大量研究[68-70]。ADSC可通過上調調節性T細胞，促進外周血嵌合體形成，抑制同種異體免疫作用[71]，并能加快血管化早期建立，改善缺血再灌注損傷，使得同種異體ADSC移植也成為近年來臨床研究的熱點。Alofisel（Cx601）作為一種局部注射的同種異體脂肪源性干細胞懸浮液，經臨床試驗證明，具有治療克羅恩病患者復雜性肛瘺的潛力，目前已被FDA批準上市[72]。將同種異體的正常大鼠ADSC應用于治療糖尿病大鼠皮膚損傷取得了明顯成效，但缺乏臨床試驗支持[73]。

ADSC的分化潛能使之在再生醫學中的應用十分廣泛，其旁分泌的各種因子（細胞因子、趨化因子和生長因子等）更是在組織工程研究中獲得關注。ADSC作為干細胞的一員，因其強大的分化潛能、強旁分泌能力、強促血管化能力，使它正迅速成為脂肪工程細胞來源的金標準[74]。

4 結論和展望

綜上所述，ADSC來源廣泛，提取方便，具有穩定的增殖能力和低衰老率，已獲得廣泛應用。目前，移植成活率的問題主要取決于如何提高移植后的血管化，這是主要的研究方向和難點：①脂肪組織工程研究中，已從支架構造、種子細胞培養、微環境改善等多方面進行了嘗試，然而還未得出完善的方案，具體如何組合各個影響因素、所用濃度劑量、作用方式等都要繼續研究；②ADSC促血管化的機制并未完全闡明明確；③雖然ADSC在組織工程和各疾病領域都有著廣泛的應用前景，但距離臨床應用還存在一定的距離，需要深入研究。