以興奮性毒性機制為靶點的神經保護策略研究進展

劉玉玉綜述，王 強審校

興奮性毒性是最早發現并被廣泛認可的腦缺血卒中后損傷的分子機制之一，當大腦處于缺血缺氧狀態，由于代謝障礙，導致興奮性神經遞質釋放增加與重攝取出現障礙，最終導致大腦缺血區域興奮性神經遞質的水平迅速升高[1]。隨后谷氨酸受體的激活導致鈣內流和神經元去極化，進而導致大腦中許多鈣依賴通路的異常激活和壞死、凋亡和自噬過程的啟動[2]。研究表明由谷氨酸介導的興奮性毒性是導致缺血性腦卒中、癲癇、阿爾茨海默病、精神疾病、帕金森病、肌萎縮側索硬化病等神經系統疾病神經元損傷的重要作用機制[3]。自上世紀50年代興奮性毒性的概念提出以來，關于谷氨酸釋放、轉運體功能改變、受體表達及其引起的下游細胞死亡信號的激活等已成為腦缺血損傷機制的研究重點。本文綜述了近幾十年以興奮性毒性機制中的重要環節為靶點的神經保護策略，并對新一代興奮性毒性抑制劑如何在上一代藥物失敗的情況下獲得成功進行分析，以期為興奮性毒性機制的研究和神經保護藥物的研發提供幫助。

1 谷氨酸受體及病理激活機制

中樞神經系統的谷氨酸受體包括離子依賴型和代謝型，根據選擇性激動劑，離子型谷氨酸受體可分為NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受體、AMPA(α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸)受體及KA(海人藻酸)受體[4]。代謝性谷氨酸受體主要是與G蛋白耦聯的受體。其中NMDA受體在缺血性腦損傷的發生機制中占據主要地位，是神經保護類藥物研發的重要靶點。

離子依賴型谷氨酸受體是配體門控通道中最具代表性的一類受體，它們具有細胞外谷氨酸結合位點和跨膜離子通道[5]。在靜息狀態下，NMDARs的通道空隙通常被Mg2+阻斷。當谷氨酸從突觸前膜釋放后，激活的AMPAR導致突觸后膜的部分去極化，其足以清除阻滯在NMDAR離子通道中Mg2+，一旦NMDAR被激活，離子通道打開，細胞外的Na+和Ca2+內流入細胞[6]。在興奮性毒性中，過量釋放的谷氨酸導致NMDARs過度激活，Ca2+內流增加，致使神經元內鈣超載。鈣超載可觸發一系列下游促死亡信號事件，如鈣蛋白酶激活、活性氧生成、線粒體損傷等，致使細胞壞死或凋亡[7]。

2 靶向NMDAR的藥物研究進展

鑒于NMDAR在興奮性毒性的重要作用，最初的治療策略主要是阻斷受體。NMDAR上有許多藥理學上可以利用的位點，包括離子通道孔、谷氨酸結合位點、甘氨酸結合位點等，NMDA受體拮抗劑主要通過靶向上述位點發揮神經保護作用。

根據藥物作用靶點的差異，谷氨酸受體拮抗劑可分成競爭性和非競爭性受體拮抗劑。非競爭性拮抗劑主要在通道空隙水平阻斷NMDAR，從而減少鈣的流入。鹽酸瑞馬西胺、鹽酸阿替加奈、MK-801(dizolcipine)、美金剛、dextromethorphan、及其代謝物dextrorphan等是近年來研發的非競爭性NMDA受體拮抗劑，它們在體外培養的神經細胞實驗和動物實驗中都顯示出神經保護作用，但遺憾的是，在隨后的臨床試驗中，除美金剛外其他的藥物均未展現出神經保護作用。競爭性受體拮抗劑通過競爭性結合谷氨酸結合位點來抑制受體的過度激活。當前研發的競爭性NMDA受體拮抗劑主要有賽福太和D-CPP-ene，研究表明這兩種藥物均可減輕神經元損傷和降低梗死體積，但接下來的兩項Ⅲ期臨床試驗顯示與對照組相比，實驗組的死亡率增加，因此這兩種藥物在臨床也被暫停使用。

研究表明NMDAR需要甘氨酸(協同激動劑)協同激活[5]。在協同激動劑和激動劑都與受體上的位點結合后，選擇性陽離子通道打開，陽離子內流(尤其是Na+、Ca2+、K+)[5]。甘氨酸位點競爭性拮抗劑Gavestinel和Licostinel，通過競爭性結合甘氨酸結合位點，來抑制NMDA受體激活，與直接阻斷NMDA受體的藥物相比，Gavestinel和Licostinel的不良反應更少。研究發現與許多NMDA受體拮抗劑相比，Licostinel可能是一種更安全、更耐受的神經保護劑。但遺憾的是，諾華公司在發現一些患者的尿液中含有可能有害的Licostinel晶體后推遲了進一步的研究。2005年，CoCensys終止了Licostinel的研發。Sacco等開展的多中心GAIN試驗顯示在急性缺血性卒中后6 h內使用gavestinel，與安慰劑組對比，實驗組在3個月時神經功能沒有改善，在后續的數據分析中，梗死面積(MRI)也無明顯差異[8]。

3 靶向NMDAR亞基的藥物研究

最近的研究表明NMDA受體在神經元的存活和死亡中具有雙重作用，NMDARs的正常激活在突觸可塑性、大腦發育、學習和記憶等方面發揮重要作用，然而，當NMDARs在病理狀態下被過度激活時，會引發神經毒性級聯反應，導致神經元死亡[9]。NMDA 受體拮抗劑在治療劑量下，除抑制受體的異常激活，受體正常的生理活動也會受到影響，導致嚴重的副作用，如惡心、嘔吐、心血管和精神方面的影響等。因此，選擇性抑制受體過度激活而保留正常的受體活動成為藥物研究的新目標。

NMDAR由兩個GluN1亞基和兩個GluN2亞基構成的異質四聚體。兩個GluN1亞基構成了離子通道的主體結構，NMDARs的主要特性由其決定，GluN2亞基在NMDAR功能中主要起調節NMDAR離子通道的作用[10]。GluN2亞基可以是GluN2A-GluN2D，也可以是GluN3A和GluN3B[11]。不同亞基構成的NMDAR具有不同的作用，在腦內的分布部位也有很大差異。最近的研究表明，NMDARs在神經元存活和死亡中的雙重作用可能取決于受體的亞細胞位置和亞型。在受體位置假說中，刺激突觸的NMDARs激活促生存信號通路，而突觸外NMDARs的激活與促死亡信號通路相關[12]。已證實GluN2A亞基主要存在于突觸內，是谷氨酸介導的神經元存活所必須的，而突觸外位點則富含GluN2B受體，被認為會導致興奮性毒性和細胞死亡。近年來，研發了選擇性抑制GluN2B的藥物，如艾芬地爾及其衍生物依利羅地(eliprodil)(SL-82.0715)和曲索羅地( traxoprodil) (CP-101,606)，這些藥物沒有傳統NMDAR拮抗劑的副作用。然而這些藥物用于臨床的有效性與安全性仍需更多的研究來證實。

4 干預NMDAR的下游死亡信號通路的治療策略

由不同的亞基組成的NMDARs在突觸與突觸外的分離并不是絕對的，因此選擇性抑制突觸外的含GluN2B的NMDARs仍有可能拮抗突觸含GluN2A的NMDARs。近年來，研究人員建議將NMDAR的下游死亡信號通路作為研究目標，而不再局限于受體本身。這種方法主要針對下游的死亡信號通路而對NMDARs介導的正常生理過程沒有影響。

GluN2B-PSD95-nNOS通路是在與膜結合的NMDARs相關的多蛋白復合物中發現的一種特征明顯的神經元死亡信號通路[6]。PSD95(突觸后蛋白密度為95KDa的支架蛋白)為NMDARs和包括nNOS(一氧化氮合酶)在內的下游分子提供了一種結構性連接[13]。當NMDARs被過度激活時，內流的Ca2+通過鈣調蛋白激活nNOS，從而產生過量的NO(一氧化氮)，NO是一種活性氮，能與自由基超氧化物相互作用形成過氧亞硝酸鹽，這是一種可導致蛋白質硝化和氧化、脂質過氧化和直接DNA損傷的強氧化劑，過量產生的NO最終可導致細胞死亡[14]。破壞GluN2B-PSD95-nNOS復合物可以抑制NMDA介導的NO的生成，保護神經元。抑制NO產生的一種方法是使用結合PSD95或nNOS的干擾肽，最近研發的被稱為Tat-NR2B9c或NA-1的干擾肽可將NMDARs與PSD95分離，并減弱下游神經毒性信號[15]。在大鼠體內進行的研究表明，在缺血性卒中后給于NA-1可減少梗死面積，改善神經行為功能[16]。一項在加拿大和美國14家醫院進行的,用于評估NA-1用于人類缺血性腦損傷療效的一項雙盲、隨機、對照研究表明與對照組相比，NA-1治療組降低了梗死體積，且具有更好的預后效果[17]。最近研究發現，ZL006和IC87201也可干擾GluN2B-PSD95-nNOS通路來發揮神經保護作用，然而它們在臨床使用的療效和安全性仍有待進一步研究來證明。

抗氧化劑通過抑制NO介導的氧化和硝化應激也可發揮神經保護作用，傳統的抗氧化劑，如依達拉奉、胞磷膽堿、替扎拉特等在多項臨床試驗的薈萃分析中均顯示出神經保護的效果。同時研究還發現尿酸、褪黑素、EPO等非傳統抗氧化劑在多項臨床研究中也表現出神經保護作用，但還需更多研究來證明其療效與安全性。

DAPK1(死亡相關蛋白激酶1)是一種依賴于Ca2+/鈣調蛋白的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其活性與細胞凋亡有關[18]。在正常狀況下，DAPK1的活性被自身磷酸化抑制，當與Ca2+結合激活CaM后，DAPK1的抑制被解除，表現出促凋亡的活性[19]。在缺血性腦卒中中，過多的Ca2+流入細胞，激活CaM和鈣調神經磷酸酶(CaN),進而使DAPK1脫磷和活化[20]。研究表明，活化的DAPK1在缺血損傷后被招募到NMDARs的GluN2B亞基[21]。最近研發的使DAPK1與GluN2B亞基解耦的干擾肽Tat-GluN2BCT1292-1304，在活體實驗中被證實具有神經保護作用，但其作用機制與療效仍需更多的實驗來證明[6]。腫瘤抑制因子P53是DAPK1的一種底物，是一種轉錄調節劑，控制缺血性卒中和神經退行性疾病的細胞死亡途徑。一種干擾P53與DAPK1相互作用的干擾肽Tat-P53DM241-281已被Wang等證明在MACO后6 h給予可減少梗死體積，改善神經行為[22]。

此外基于更下游死亡信號蛋白的研究，如Calpains(鈣激活酶)、MAPKs(絲裂原活化蛋白激酶)、SREBP1(固醇調節元件結合蛋白)等也研發出一些藥物，這些藥物在體外和動物試驗中都展示出神經保護作用。

5 干預谷氨酸釋放和重攝取的治療策略

除了干預NMDARs的下游死亡信號通路，干預谷氨酸釋放和重攝取也是最近科學家研究的較多的神經保護治療策略，這種治療策略從源頭解決NMDARs的過度激活，在一些研究中已經表現神經保護的潛能。

正常情況下，釋放到突觸間隙的谷氨酸會被谷氨酸轉運體迅速清除，以保持突觸中谷氨酸平衡。在腦缺血、缺氧等的病理情況下，ATP的產生和利用出現障礙，導致Na+/K+ATP酶功能障礙，K+在胞外堆積，使細胞去極化，Na+濃度梯度被破壞，轉運體無法攝取胞外谷氨酸[23]，最終導致突出間隙谷氨酸過度堆積，產生興奮性毒性作用。

谷氨酸轉運體(EAAT)有5種類型(EAAT1-EAAT5)，其中EAAT2負責腦內大部分谷氨酸的清除，增強EAAT2活性或其在神經元和膠質細胞膜上表達可能為抑制興奮性毒性提供一種新的治療方法[24]。研究發現，頭孢曲松能增加肌萎縮側索硬化癥小鼠模型中的EAAT2活性[25]，目前正在進行這方面的臨床研究。此外有報道稱，具有復雜作用機制的利魯唑也能提高谷氨酸轉運體的活性[26]，但目前還沒有針對卒中或者創傷性腦損傷等的臨床試驗。

研究表明，在大腦和血液之間創造一個更大的谷氨酸濃度梯度，可以提高谷氨酸從大腦流向血液的速度。因而使用血液谷氨酸清除劑，也可能具備潛在的神經保護作用。谷氨酸清除劑如草酰乙酸、丙酮酸、谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶和谷氨酸-丙酮酸轉氨酶已被證明可以降低血液中谷氨酸濃度，從而增加大腦對谷氨酸外排的驅動力，進而降低大腦谷氨酸水平[27]。

6 思考及展望

盡管過去幾十年來以興奮性毒性機制為靶點的藥物研發成指數式增長，但目前臨床上推薦用于卒中和多種神經退行性疾病的神經保護藥物屈指可數。這背后涉及多方面的原因，既有動物實驗向臨床試驗轉移的失敗，也有藥物嚴重的不良反應導致的藥物研發的終止。但令人興奮的是，隨著分子生物學和藥理學進展，我們對NMDA受體及其下游死亡信號通路和谷氨酸的清除機制有了更深的了解，針對這些新的治療靶點研發的藥物與傳統的NMDA受體拮抗劑相比，具有廣泛的治療時間窗和更少的不良反應。然而針對這些新靶點的藥物多停留在動物實驗階段，其臨床有效性與安全性還需臨床試驗來驗證。

有研究指出興奮性毒性可通過多條死亡通路和多個靶點導致神經元死亡，因此只針對單一靶點的藥物可能療效不佳，同時聯合針對多個靶點的藥物可能具有協同作用，因此針對多個靶點的神經保護藥物也是未來研發的重要方向。