生物支架材料在骨組織工程中的應(yīng)用

李雪雯，劉堯，李波

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 1.口腔解剖生理學(xué)教研室；2.兒童口腔科，沈陽(yáng) 110002）

由頜面部腫瘤、先天畸形以及頜面部創(chuàng)傷導(dǎo)致的骨組織缺損是臨床醫(yī)療過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題，同時(shí)亦是頜面外科所面臨的一個(gè)難題［1］。近年來(lái)，伴隨骨組織工程的不斷深入研究和發(fā)展應(yīng)用，人工制備的生物材料逐漸成為了新型的骨組織替代物，為臨床治療骨組織相關(guān)疾病提供了一條新的思路［2］。隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、材料學(xué)以及工程學(xué)等相關(guān)學(xué)科的不斷發(fā)展，兼具多種理化和生物性能的骨組織工程支架材料應(yīng)運(yùn)而生，這也為組織工程化骨的構(gòu)建提供了寶貴基礎(chǔ)和條件。骨組織工程的核心在于建立包括種子細(xì)胞在內(nèi)的具有生物活性的三維結(jié)構(gòu)復(fù)合體，即構(gòu)建出具有生物活性和功能的組織，用以重塑病損組織的形態(tài)、恢復(fù)其結(jié)構(gòu)與功能，同時(shí)對(duì)已有的缺損組織進(jìn)行永久替代。骨組織工程原理的研究應(yīng)用拓寬了以往對(duì)于骨相關(guān)疾病診療方法的認(rèn)知范圍［3］。本研究對(duì)生物支架材料在骨組織工程中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 天然支架材料在骨組織工程中的應(yīng)用

1.1 膠原

膠原是由多種類(lèi)型的糖蛋白構(gòu)成，約占機(jī)體內(nèi)總蛋白含量的30%［4］，其中約85%為Ⅰ型膠原。膠原作為來(lái)自于生物體內(nèi)的天然高分子材料具有較為良好的生物相容性，降解性良好且能夠進(jìn)行調(diào)節(jié)，因而Ⅰ型膠原作為承載細(xì)胞的支架材料有利于促進(jìn)細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)和分化，能夠較好地發(fā)揮引導(dǎo)組織再生的作用［5］。ZHOU等［6］通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)對(duì)接種于膠原/羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）復(fù)合纖維上的細(xì)胞進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示該復(fù)合纖維不僅對(duì)細(xì)胞無(wú)體外細(xì)胞毒性，并且能夠促進(jìn)其黏附及增殖。

目前，應(yīng)用于骨組織工程的膠原支架類(lèi)型主要包括呈現(xiàn)多孔狀的膠原海綿與表現(xiàn)為半固態(tài)性質(zhì)的膠原凝膠。其中，膠原海綿已經(jīng)作為醫(yī)用止血制品在臨床方面得到了廣泛的應(yīng)用；多孔狀的膠原海綿既有較好的生物安全性，又可以保持較高的孔隙率，能夠作為骨組織工程支架材料的來(lái)源。目前，多孔膠原海綿作為三維空間支架材料應(yīng)用于多種細(xì)胞（人成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及骨髓細(xì)胞等［7］）的培養(yǎng)。膠原凝膠表現(xiàn)為半固態(tài)、半液態(tài)，具有一定的可流動(dòng)和可塑特性。對(duì)于美容整形外科來(lái)說(shuō)，商品化的膠原凝膠可作為一種軟組織的填充替代物，已有研究［8］將膠原凝膠作為支架材料，成功對(duì)腔隙性的骨組織缺損進(jìn)行了修復(fù)重建。

1.2 絲素蛋白（silk fibroin，SF）

蠶絲是一種天然纖維，由內(nèi)層的絲素和外層的絲膠構(gòu)成，SF屬于蠶絲的重要組成成分。作為一種無(wú)不良反應(yīng)的天然生物材料，SF具有良好的生物相容性和降解性［9］，不會(huì)引起機(jī)體免疫應(yīng)答，并且能夠促進(jìn)黏附的多種細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖。同時(shí)，SF具備良好的物理化學(xué)性質(zhì)和機(jī)械性能，經(jīng)力學(xué)牽拉檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SF具備良好的機(jī)械力學(xué)性能，能夠承載較強(qiáng)的拉力［10］，因而將SF作為支架材料應(yīng)用于骨組織工程［11］。

SAHU等［12］將成骨細(xì)胞與SF進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)SF可于體外誘導(dǎo)骨組織生成，說(shuō)明SF可以成為類(lèi)骨組織的基質(zhì)材料。已有研究［13］將人間充質(zhì)干細(xì)胞接種至多孔SF支架材料上，于體外成骨培養(yǎng)基內(nèi)復(fù)合培養(yǎng)8周，然后將細(xì)胞支架復(fù)合體植入小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示存在臨界骨缺損的部位形成了以橋接形式連接的新骨。目前，兼?zhèn)淞己蒙锵嗳菪院涂山到庑缘腟F可以加工成膜、凝膠、支架等多種形式，在骨組織工程領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［14］。

1.3 殼聚糖（chitosan，CS）

CS是迄今為止自然界唯一帶正電的天然堿性多糖，具備生物降解性可控、組織相容性?xún)?yōu)良、安全無(wú)不良反應(yīng)、無(wú)免疫原性且能抗細(xì)菌和真菌的特性，是具有廣泛應(yīng)用前景的組織工程天然高分子聚合物［15-17］。

EZODDINI-ARDAKANI等［18］建立了大鼠脛骨骨缺損模型，將CS粉末植入實(shí)驗(yàn)組大鼠右側(cè)脛骨骨缺損的部位，結(jié)果表明CS對(duì)大鼠脛骨的骨再生存在明顯的促進(jìn)作用，同時(shí)進(jìn)一步證明了CS兼?zhèn)淞己玫纳锵嗳菪砸约肮钦T導(dǎo)性。CS能夠制備形成各種性狀，目前常用的制備方法為真空冷凍干燥法，經(jīng)由真空凍干消除冰晶并形成多孔結(jié)構(gòu)，通常認(rèn)為將支架的孔徑范圍控制在100～150 μm更利于細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)和血管的形成［19］。

為了使支架材料具備可注射性，已制備出可注射的CS水凝膠，CS水凝膠能夠作為活細(xì)胞的載體并保持其活性。閆繼紅等［20］制備了CS/β-甘油磷酸鈉溫敏凝膠，觀察發(fā)現(xiàn)凝膠體系在常溫狀態(tài)下為流動(dòng)性液體，當(dāng)溫度升至37 ℃時(shí)能夠凝固成膠；將凝膠與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，結(jié)果顯示接種于凝膠上的細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好，進(jìn)一步表明CS/β-甘油磷酸鈉凝膠具備良好的生物相容性，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，可作為組織工程支架材料。

2 人工合成支架材料在骨組織工程中的應(yīng)用

2.1 無(wú)機(jī)材料

HA是骨鹽的主要組分，也是牙齒的重要無(wú)機(jī)礦物質(zhì)。在組織工程中，HA有著較為良好的骨傳導(dǎo)性與化學(xué)穩(wěn)定性，可以為種子細(xì)胞提供進(jìn)行成骨分化的微環(huán)境。同時(shí)，以人工方法合成的HA具備了和人體自然骨中無(wú)機(jī)成分相類(lèi)似的化學(xué)成分與結(jié)構(gòu)，因而在生物醫(yī)療方面可以將人工合成的HA用作骨組織的替代物。與其他類(lèi)型的人工合成材料比較，HA兼具優(yōu)良的生物安全性、生物活性以及能夠與機(jī)體組織發(fā)生鍵合羥基基團(tuán)，植入機(jī)體內(nèi)安全且無(wú)不良反應(yīng)，對(duì)機(jī)體組織具有親和性、不引起免疫排斥反應(yīng)。此外，HA的構(gòu)成成分當(dāng)中包含鈣和磷元素，可以參與機(jī)體的正常新陳代謝過(guò)程。然而，以HA構(gòu)建而成的人工骨雖具備良好的骨傳導(dǎo)性能，但卻不具有骨誘導(dǎo)的特性，因此在應(yīng)用方面受到一定程度制約。

近些年，伴隨組織工程研究的不斷深入，為了能夠使植入缺損部位的替代物兼具骨誘導(dǎo)性和成骨性能，研究［21］顯示將具備骨誘導(dǎo)性或成骨作用的材料與HA結(jié)合，可制備形成既擁有骨傳導(dǎo)性能，又具備骨誘導(dǎo)性或者成骨作用的復(fù)合型支架材料。

2.2 有機(jī)高分子材料

近年來(lái)，隨著人工可降解高分子聚合材料的不斷發(fā)展，聚乳酸類(lèi)高分子聚合物在醫(yī)學(xué)方面［手術(shù)縫合線、藥物緩（控）釋體系等］廣泛應(yīng)用，已經(jīng)成為當(dāng)前應(yīng)用范圍最廣的組織工程支架材料之一［22］。目前常用的人工高分子聚合物種類(lèi)較多，其中以聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚羥基乙酸（polyglycolic acid，PGA）以及二者共聚體［poly（D，L-lactic-co-glycolic）acid，PLGA］應(yīng)用最廣［23］。在組織工程中，已經(jīng)采用了多種方法（熱致相分離、發(fā)泡以及靜電紡絲等［24-25］）對(duì)聚乳酸類(lèi)生物材料進(jìn)行制備。制備完成的PLA、PGA以及PLGA主要應(yīng)用形式有多孔纖維支架、泡沫結(jié)構(gòu)與管狀結(jié)構(gòu)等，這些形式材料在骨組織工程應(yīng)用均呈現(xiàn)出了較好的誘導(dǎo)成骨效應(yīng)［26］。

PLA與PGA已作為骨、軟骨、肌腱和心臟瓣膜等各類(lèi)組織工程細(xì)胞外支架材料廣泛應(yīng)用，并已初步獲得成功。LI等［27］報(bào)道將小鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞接種于PLGA/明膠支架上進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明坐骨神經(jīng)細(xì)胞可以在支架上很好黏附、生長(zhǎng)。HU等［28］在改良式PLGA支架材料上接種小鼠血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，于第2、4、7天分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行MTT檢測(cè)，結(jié)果顯示復(fù)合于支架上的細(xì)胞生存狀況良好且增殖速率未受影響。目前，盡管PLA、PGA與PLGA作為支架材料在組織工程應(yīng)用方面較為廣泛，卻仍然存在不可忽視的缺點(diǎn)，包括（1）親水性較差、對(duì)細(xì)胞的吸附能力不強(qiáng)；（2）容易引發(fā)機(jī)體出現(xiàn)無(wú)菌性炎癥；（3）機(jī)械力學(xué)性能不足以及制備共聚物過(guò)程中殘余的有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞和周?chē)M織的毒性作用等。

3 復(fù)合支架材料在骨組織工程中的應(yīng)用

單一類(lèi)型材料（天然高分子材料、人工高分子聚合物等）雖各具優(yōu)勢(shì)，但作為支架材料仍難以滿足骨組織工程的全部要求。例如，天然高分子聚合材料盡管具備優(yōu)良的生物相容性和降解性，但是仍存在機(jī)械性能不強(qiáng)，骨誘導(dǎo)能力不佳等問(wèn)題，如若將其作為骨組織工程支架材料單獨(dú)使用則修復(fù)效果會(huì)受到影響。針對(duì)天然高分子材料面臨的這些問(wèn)題，可以通過(guò)物理、化學(xué)混合或改性的方式來(lái)提高其力學(xué)和生物學(xué)特性。此外，將人工高分子聚合材料與生物陶瓷類(lèi)材料相復(fù)合能夠使人工高分子物的機(jī)械性能加強(qiáng)，并能夠?qū)ζ湓诮到夂螽a(chǎn)生的酸性物質(zhì)進(jìn)行中和，進(jìn)一步提高支架的骨結(jié)合能力與組織相容性。

HUNTER等［29］報(bào)道將骨髓基質(zhì)細(xì)胞與HA/CS/明膠支架復(fù)合后可誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨分化，說(shuō)明材料中的3類(lèi)成分存在協(xié)同促成骨的作用。HA的機(jī)械性能不佳，無(wú)法用于進(jìn)行高強(qiáng)度受力部位的骨組織再生，因而可利用多糖類(lèi)材料對(duì)HA的機(jī)械強(qiáng)度（壓縮強(qiáng)度、壓縮模量等）進(jìn)行改性。FROHBERGH等［30］以京尼平作為交聯(lián)劑制備了靜電紡絲HA/CS支架，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)后的支架材料表面的HA分布均勻，性質(zhì)穩(wěn)定，且復(fù)合于支架內(nèi)的細(xì)胞其成骨分化能力得到了明顯提高。

碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）具備較強(qiáng)的壓縮模量和拉伸強(qiáng)度，并且有良好結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物活性，因此，這些優(yōu)點(diǎn)使CNTs成為了極具發(fā)展前景的應(yīng)用型材料。USUI等［31］首次報(bào)道合成了CNTs，并指出其具備良好的骨組織相容性，當(dāng)CNTs負(fù)載骨形態(tài)發(fā)生蛋白后可以刺激、加速骨形成，促進(jìn)骨的修復(fù)與整合。ARYAEI等［32］將CNTs加入CS中，分別制備濃度為0.1%、0.5%和1%的CNTs/CS復(fù)合膜，發(fā)現(xiàn)復(fù)合材料在拉伸強(qiáng)度、彈性模量等性能方面出現(xiàn)了大幅度提高，因此復(fù)合CNTs可使CS的拉伸性能、彈性模量等機(jī)械特性明顯提升。

ARIANI等［33］利用凍干技術(shù)制成具備三維連接多孔結(jié)構(gòu)的碳酸磷灰石/CS支架，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了該支架能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化。將鈣磷酸鹽與CS進(jìn)行復(fù)合制備而成的脫乙酰聚糖/磷酸鈣支架具備更佳的生物學(xué)性能，通過(guò)機(jī)械力學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示該支架具有與人骨小梁相似的抗壓強(qiáng)度，并且將支架與MG63細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)，結(jié)果顯示細(xì)胞在支架上的黏附、增殖、分化情況均良好［34］。FLORCZYK等［35］以CS/藻酸鹽支架植入至SD大鼠骨缺損區(qū)域內(nèi)，并分別于植入后第4、16周進(jìn)行對(duì)缺損處進(jìn)行micro-CT檢測(cè)，通過(guò)組織學(xué)結(jié)果分析表明，利用負(fù)載骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）的支架處理的SD大鼠在第16周的新骨形成率達(dá)70%左右。

4 總結(jié)與展望

用于組織工程的支架材料在形狀上需要對(duì)復(fù)雜的缺損區(qū)域進(jìn)行完全充填；在機(jī)械性能方面能夠在組織修復(fù)完成之前暫時(shí)替代缺損處的組織；支架材料在生物相容性方面應(yīng)該具備一定的生物活性，為細(xì)胞提供適宜的黏附增殖環(huán)境并誘導(dǎo)組織再生［36］；此外，支架還應(yīng)具備可植入性，能夠通過(guò)手術(shù)方式植入體內(nèi)并固定于缺損部位，從而達(dá)到預(yù)期修復(fù)目標(biāo)。雖然現(xiàn)階段關(guān)于骨組織工程支架的相關(guān)研究較多，然而至今為止仍未能找到或構(gòu)建出一種完全與組織工程支架標(biāo)準(zhǔn)相符合的材料。

口腔頜面部骨組織不同于機(jī)體其他部位的規(guī)則骨，其在解剖形態(tài)與生理功能方面均存在一定的特殊性。因而，傳統(tǒng)的組織工程支架制備方法（凍干法、靜電紡絲等）難以制備出在結(jié)構(gòu)上具有個(gè)性化體現(xiàn)、完全適用于頜面部骨的組織工程支架。3D打印模式為解決這一問(wèn)題指出了新的思路。3D打印技術(shù)（快速成型技術(shù)）是一種以計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)（computer aided design，CAD）數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，經(jīng)由快速成型機(jī)，通過(guò)分層加工和迭加成型的方法，由快速成型機(jī)逐層添加材料，從而制備形成材料的3D實(shí)體。常用作制備骨組織工程支架的3D打印技術(shù)包括熔融沉積成型法（fused deposition molding，F(xiàn)DM）、選擇區(qū)域激光燒結(jié)法（selective laser sintering，SLS）、立體光固化印刷法（stereo lithography appearance，SLA）以及3D生物打印法（3D bioprinting，3DP）［37-38］。目前，已有研究將3D打印技術(shù)與骨組織工程技術(shù)結(jié)合，針對(duì)口腔頜面部的頜骨及牙槽骨缺損進(jìn)行修復(fù)并取得較好效果［39］。

近年來(lái)，伴隨材料學(xué)、工程學(xué)以及生命科學(xué)的不斷進(jìn)步，研究人員也逐步意識(shí)到單一使用某種材料具有局限性和缺陷性，由此復(fù)合型支架材料得以不斷發(fā)展。但是，復(fù)合型材料雖然在性能方面有所提升，其在臨床應(yīng)用等方面仍存在一些問(wèn)題。例如，將骨替代物植入缺損部位后，如何控制復(fù)合材料的降解速度，使其與組織細(xì)胞生長(zhǎng)以及新骨形成的速率匹配和適應(yīng)；如何調(diào)整材料內(nèi)部各組分的比例，使復(fù)合支架材料具備較高機(jī)械力學(xué)強(qiáng)度的同時(shí)兼具較好的孔隙率和孔徑。這些問(wèn)題不僅決定了支架材料的理化和生物學(xué)性能，同時(shí)還影響骨組織工程產(chǎn)品發(fā)揮其應(yīng)有的效果。因此，能否成功獲得具有理想性能的支架材料，對(duì)于骨組織工程的應(yīng)用范圍及效果具有重要意義。