ESRPs在上皮間質轉化中的作用及其調控機制研究進展

王白鶴 孫建方

上皮-間質轉化(EMT)使上皮細胞失去極性獲得間充質表型，從而具有侵襲和轉移的能力，它是胚胎發育所必需的過程[1]，并且與癌癥進展相關[2]。除了受相關轉錄因子的調節外，EMT還可以在轉錄后水平被調控，上皮剪接調節蛋白1和2(ESRP1和ESRP2)已被描述為參與EMT相關的上皮特異性剪接調節劑。本篇文章主要針對ESRPs介導的剪接變體在EMT相關上皮表型調節中的作用和調控機制[3]，以及與腫瘤發生發展的相關性作一綜述。

1 上皮-間質轉化(EMT)程序

許多細胞外信號通路，比如TGFβ，Notch，Wnt，FGF和HGF能夠通過誘導EMT-TF(Snail，Slug，ZEB1，ZEB2和Twist)的表達來促進EMT過程。這些信號傳導途徑與胚胎發育密切相關。轉錄因子的誘導通常導致E-鈣黏蛋白的喪失，這是EMT的首要表現之一。 E-鈣黏蛋白的抑制是通過在編碼CDH1基因的E-鈣黏蛋白的啟動子位點的E盒處形成抑制性復合物來介導的。E-鈣黏蛋白的喪失，以及緊密連接和黏附連接功能的喪失以及細胞頂端-基底極性都是EMT的標志，并且導致以間充質標記物的高表達為特征的細胞類型，例如波形蛋白表達，細胞形狀變成紡錘形，以及獲得遷移和侵襲能力[4]。反向程序MET在胚胎發育過程中驅動先前間充質細胞向上皮細胞轉化，可能導致EMT途徑的下調，但是關于抑制EMT或促進MET的特定轉錄途徑目前研究較少。

EMT程序的失調與腫瘤發病機制密切相關。絕大多數致命的人類癌癥是源自上皮組織的腫瘤，例如來源于乳腺、肺、胰腺和結腸的腫瘤。雖然早期腫瘤保留了許多正常上皮細胞的特征，但高度侵襲性的腫瘤獲得間充質特征，從而可以侵入周圍的基質[5]。實際上，在宮頸癌、結腸癌、甲狀腺癌和乳腺癌的腫瘤侵襲過程中可以發現EMT的表達，包括E-鈣黏蛋白表達的喪失，波形蛋白表達的增加和遷移能力的明顯增強。盡管有大量的體內研究與異種移植或遺傳小鼠模型支持EMT在腫瘤進展中的因果作用，但是EMT對人類癌癥和轉移的準確影響仍然存在爭議，原因是原發腫瘤樣本的證據不足[6]。有研究在癌旁組織發現了E-鈣黏蛋白的低表達，其他轉移的腫瘤細胞未顯示EMT的跡象。最近發現，EMT還與干細胞特性和耐藥性的獲得有關[2]，這表明EMT在腫瘤發生中具有重要的選擇性作用。由于胚胎發育的重要性以及尚未完全闡明的致癌作用，EMT過程有待進一步研究。

2 ESRPs在細胞上皮表型調節中的作用

使用各種生物信息學工具和功能性交互網絡分析發現ESRPs與EMT過程密切相關。多種研究顯示在敲除或過表達ESRPs細胞中，受影響的功能途徑存在大的重疊。具體而言，眾多研究的途徑分析一致證明，主要涉及細胞黏附，細胞遷移運動和細胞骨架調節三方面，這些都是特征性地區分上皮細胞和間充質細胞的途徑[6]。ESRP靶向的大多數轉錄編碼蛋白具有上皮細胞功能，但是還不清楚ESRP誘導的上皮剪接變體是如何調節上皮表型的。最近相關研究進展表明，這些上皮剪接變體類似于FGFR2，是通過各種機制對上皮細胞功能發揮著重要影響。

2.1 影響細胞黏附的上皮剪接蛋白變體 p120-Catenin：成熟的基于E-鈣黏蛋白的黏附連接點是上皮細胞的主要標志，作為鈣黏蛋白-連環蛋白復合物的一部分，p120-連環蛋白與鈣黏蛋白的細胞質結構域結合，并且通過內吞作用和蛋白酶體降解來阻止其下調，從而作為鈣黏蛋白穩定性和功能的主要調節劑[7-9]。p120-連環蛋白的其他功能包括調節Rho-GTP酶信號傳導和轉錄調節，特別是充當了Wnt信號傳導通路的調節劑[10，11]。編碼p120-連環蛋白的人CTNND1基因具有四個不同的翻譯起始位點和四個可變剪接的外顯子。目前區分的最相關的剪接變體是含有替代外顯子2和3的相對長的間充質特異性剪接變體。間充質p120變體的異常表達與癌癥進展有關，可能是通過核信號傳導或通過影響Rho-GTP酶信號傳導的機制[10，11]。有研究發現p120-連環蛋白的長間充質異構體可以促進MDA-MB-231細胞的侵襲性，這依賴于它們抑制RhoA活化的能力[12]。

CD44：CD44蛋白是普遍表達在跨膜細胞的表面蛋白。CD44的細胞外結構域主要作為細胞外基質分子透明質酸的受體起作用，并且具有其他ECM組分和細胞表面受體的其他結合位點。CD44的細胞質結構域與肌動蛋白細胞骨架間接相關，并介導其信號功能，從而控制細胞-細胞和細胞-基質黏附，細胞遷移、運動和信號傳導[13]。AS可以產生多種CD44 mRNA轉錄物。外顯子1-5和外顯子16-20通常拼接在一起，并編碼標準CD44s蛋白異構體。另外包含10個可變中間體外顯子產生多個較長的可變剪接CD44蛋白異構體，命名為CD44v1-10[13]。較長變體形式的CD44具有延伸的細胞外莖結構域，它具有高度糖基化并提供額外的配體結合位點[13，14]。包含外顯子變體與癌癥進展相關。雖然包含一些變體外顯子，特別是CD44v4-5和CD44v6增加了轉移能力，但是v8-10的包含對于正常上皮細胞是典型的并且與E-鈣黏蛋白表達相關[14]。CD44v8-10和CD44v1-2取決于ESRP1活性[15]。由于ESRP1的喪失和切換回CD44s表達而排除這些外顯子對于EMT發生是至關重要的[15]，這表明ESRP部分地通過抑制CD44抑制EMT過程。

Integrin-α6：整聯蛋白是參與細胞基質附著的異二聚體跨膜糖蛋白。目前，已經鑒定了18個α亞基和8個β亞基，其可以形成異二聚體[16]。層黏連蛋白結合α6整聯蛋白亞基與β1整聯蛋白結合形成α6β1整合素，它和β4整聯蛋白在許多細胞類型中被發現，常見于上皮細胞，其中α6β4整聯蛋白是半橋粒的一部分。α6整聯蛋白基因ITGA6的外顯子25的AS產生兩種剪接變體α6A和α6B。最近，它顯示包含外顯子25，導致α6B的較長細胞質結構域，由ESRP1介導α6A和α6B剪接變體在胚胎發育過程中具有不同的功能和表達譜[17]。成人結腸上皮也顯示差異表達，因為α6B由靜止分化細胞表達，而α6A在增殖細胞中被發現[18]。結腸癌與表達α6A的細胞增加相關，其通過涉及α6A激活Wnt信號傳導途徑的機制導致腫瘤增殖增加[18]。尚不清楚它是否促進α6整合素向β1轉化，比如在乳腺癌干細胞中，ESRP1介導的α6整合素剪接的喪失可能促進α6Aβ1異二聚化并導致腫瘤形成[17]。

2.2 影響轉移和侵襲的上皮剪接蛋白變體 MENA：MENA是肌動蛋白調節劑Ena/VASP蛋白家族的成員。它是一種細胞內支架蛋白，調節片狀偽足，絲狀偽足,細胞-細胞連接和黏著斑中肌動蛋白絲的聚合，并參與調節細胞形態，細胞骨架排列和細胞運動。與相關家族成員ENA和VASP相反，目前已經在人類中發現了幾種甲型谷胱甘肽的AS異構體[19]。除了普遍表達的人MENA(hMENA)之外，人腫瘤細胞通常表達在正常組織中未發現的一種或多種剪接變體。其中，以跳過的外顯子6命名的hMENAΔv6與包含外顯子11a變體命名的hMENA11a互斥，hMENA11a的表達受ESRP1調節[20，21]，并與E-鈣黏蛋白表達和減少的侵襲相關，與其在上皮細胞中的特異性表達一致，與間充質細胞相反。有趣的是，兩種剪接變體在同一腫瘤中表達不同，在乳腺癌研究中，發現表達hMENA11a的細胞構成原發腫瘤的大部分，而侵襲性腫瘤細胞表達hMENAΔv6[22]，這些發現表明，hMENA AS中的ESRP1依賴性轉換控制著腫瘤細胞的侵襲。實際上，最近的研究強調了hMENAΔv6可能用作非小細胞肺癌和乳腺癌的預后生物標志物[19，23]。

Exo70：Exo70是一種八聚體蛋白復合物，與調節上皮細胞的胞吐作用和頂端 - 基底極化有關。Exo70至少有五種可變剪接的異構體[24，25]。在這些異構體中，Exo70-E表達受ESRP1控制并且是上皮特異性的，而Exo70-M存在于缺乏ESRP1的間充質細胞中。這些異構體具有不同的功能，僅有Exo80-M結合Arp2/3復合物，從而促進腫瘤細胞的侵襲。有趣的是，在間充質細胞中引入Exo70-E不僅可以抑制細胞侵襲，還可以通過一種可能依賴于抑制EMT-TF Snail的機制來獲得上皮表型[25]。據報道，Exo70還可通過結合剪接體直接調節其自身的剪接，盡管這涉及Exo70-E和Exo-70M之間共有的結合區域[24]。然而，這些研究表明由ESRP誘導的Exo70變體可能作為上游潛在的反饋調節劑起作用。

3 ESRP剪接變體調節EMT過程

雖然有充足的證據表明ESRP通過EMT相關信號通路調控上皮細胞的剪接事件，但是ESRP的表達是EMT過程的繼發結果，還是與EMT相反，是一種相對獨立的選擇性轉錄后程序，目前尚不清楚。可以明確的是，下調ESRP1和ESRP2是EMT作用的結果，該過程由EMT-TFs誘導產生[15，20，26]。

在人乳腺上皮(HMLE)細胞系中，通過他莫昔芬誘導Twist ER的表達，14天內完成Twist誘導的EMT過程，包括E-cadherin的缺失，N-cadherin的獲得，以及成纖維樣細胞的形成。RNA序列分析發現Twist-ER誘導HMLE細胞系中EMT顯著降低ESRP的表達，并導致大約1500個AS的改變[15，26]。其中，約8%與外顯子跳躍事件重疊，這些事件在先前研究中歸因于ESRPs[26]。雖然這些結果可能表明ESRP和EMT控制不同的程序，但是EMT和ESRP調控AS之間的相互作用還需進一步探索。

有實驗證據表明，敲除上皮PNT2細胞系中ESRP1和ESRP2基因，可以誘導間充質標志物的形成如波形蛋白，纖連蛋白，MMP-2和N-鈣黏蛋白，并降低E-鈣黏蛋白在質膜的定位[21]。有趣的是，MDA-MB-231細胞中ESRP1和ESRP2的表達可引起E-鈣黏蛋白升高，而不影響N-cadherin或纖維連接蛋白[27]，表明ESRP可能通過不同的機制影響E-鈣黏蛋白的表達，不同于ESRP誘導的蛋白質異構體對EMT的上游調節。最近有頭頸部鱗狀細胞癌細胞(HNSCCs)的研究表明，ESRPs可以在EMT中扮演互補角色。ESRP1控制促進運動的Rac1剪接變體Rac1b的AS[28，29]，ESRP2則通過另外一種不同的機制下調E-鈣黏蛋白的表達。ESRP2降低E-鈣黏蛋白的機制涉及EMT-TF SIP1，該過程可下調E-鈣黏蛋白轉錄[29]。目前對ESRP2如何調控SIP1及其轉錄和轉錄后機制尚不清楚[29]。

改變細胞標記物如E-鈣黏蛋白的表達可以誘導EMT程序，導致細胞形態和細胞遷移能力的改變[6]。因此，細胞功能實驗檢測ESRP1/ESRP2敲除或過表達對細胞形態和細胞遷移的影響結果發現，同時敲除ESRP1和ESRP2，或只敲除ESRP1，HMEC細胞形態發生改變，即紡錘形細胞增加，鵝卵石樣細胞以及細胞-細胞黏附減少。此外，劃痕實驗中，同時敲除ESRP1和ESRP2，或只敲除ESRP1可以促進細胞遷移[21]，Ishii等[29]在HNSCCs(SAS和HSC-4)研究中同樣證明了這一點。在HMLE-Twist細胞中過表達ESRP1后，遷移特征改變為在單層上皮細胞中的常見類型[26]。在調查對肌動蛋白細胞骨架的影響時，觀察到敲除ESRP1可促進絲狀偽足的形成，而ESRP2并沒有。這表明ESRP1和ESRP2是以不同方式抑制細胞運動：ESRP1通過細胞骨架作用，而ESRP2是通過細胞-細胞黏附方式。

4 ESRPs和腫瘤形成

在腫瘤形成過程中，AS和可變蛋白異構體一樣，可以促進腫瘤癌蛋白的形成。AS被認為腫瘤的標記物[8，30]，可以影響多個過程，包括通過表達端粒酶hTERT較短的亞型來促進復制，通過EGFR受體的可變剪接促進腫瘤的持續增殖信號的傳導[31]。AS介導的促癌過程的其他特征包括逃避生長抑制因子，減少細胞凋亡，細胞代謝失調和侵襲、轉移等[8]。

腫瘤形成與分化上皮的特征缺失有關，這與ESRPs在腫瘤形成中的作用類似，實際上，在多個腫瘤細胞系中，例如來自前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、腎癌、頭頸部鱗狀細胞癌的轉移性腫瘤細胞系中，細胞和腫瘤組織的侵襲與ESRP1和2的低表達有關[27，28，32，33]，表明了ESRPs的腫瘤抑制功能。這一觀點得到了相關研究的進一步支持，有研究表明ESRP1過表達在體外減少了胰腺癌細胞的遷移和增殖，在體內很少產生肝轉移[33]。此外，臨床數據顯示ESRP1表達水平與透明細胞腎細胞癌和乳腺癌中的患者存活率正相關[32]。在原發性結腸腫瘤微衛星轉移灶中，發現50%的ESRP1基因突變，體外實驗敲除ESRP1可以抑制癌細胞生長，表明ESRP1是結腸癌的腫瘤抑制因子[34]。

與之相反，ESRP1高表達和由此產生的CD44v8-10剪切變體與4T1小鼠模型和乳腺癌患者更高肺轉移相關[35]。ESRP1誘導的剪接變體CD44v8-10有穩定胱氨酸轉運蛋白xCT(SLC7A11)的能力，同時增加細胞對活性氧的抵抗力，使其具有潛在的致癌功能[35]。乳腺癌細胞缺氧也會引起ESRP1表達增加，促進向間質表型的轉化，但具體機制有待明確。ESRP1可促進多個乳腺癌細胞系對抗癌劑苯基丁酸酯(一種組蛋白脫乙酰基酶拮抗劑)的敏感性，因此，ESRP1降低了對化學抗性有確定作用的基因表達，例如AXL，IFI16和CAV1[36]。

關于ESRP2在腫瘤形成中的作用研究較少。在大多數透明細胞腎細胞癌患者中，ESRP1和ESRP2均有腫瘤抑制功能，但是作用機制不同。在這些腫瘤中，ESRP1 mRNA表達顯著下降，ESRP2 mRNA表達趨于穩定，但是由于Arkadia功能喪失降低了剪接活性，其促進了ESRP2誘導的剪接[37]。在HNSCCs中也報道ESRP1和ESRP2的調節，其中ESRP1通過Rac1剪接調節細胞運動[29]，而ESRP2影響細胞-細胞黏附，有數據表明ESRP1 mRNA表達水平受缺氧條件影響，而ESRP2不受影響。總之，大部分研究表明ESRPs具有腫瘤抑制作用，也有研究發現ESRP1有腫瘤保護作用，因而ESRP1和ESRP2的調控機制及其功能并不完全一致。

5 結論

ESRPs已成為上皮細胞剪接程序的主要調節因子,它通過誘導上皮表型改變，從而參與細胞-細胞黏附，細胞遷移運動和細胞骨架。闡明ESRPs在上皮間質轉化中的作用及其調控機制，將對深入了解人類胚胎發育和腫瘤的診斷治療過程具有重大指導意義。