加巴噴丁對脊神經結扎大鼠神經病理性疼痛的作用及其機制

李濤，吳越

（ 大連醫科大學附屬第一醫院 1. 神經外科；2. 麻醉科，遼寧 大連 116011）

加巴噴丁是γ-氨基丁酸衍生物，近年來臨床上用于慢性疼痛 （尤其是神經病理性疼痛） 的治療。研究［1］顯示不同病因的神經病理性痛其治療效果也不同。神經病理性疼痛的動物模型常用脊神經結扎 （spinal nerve ligation，SNL） 模型，SNL能直接誘發神經病理性疼痛［2］。TANGA等［3］2005年首次發現Toll樣受體4 （Toll like receptor 4，TLR4） 在神經病理性疼痛模型中發揮重要作用。有研究［4］報道TLR4抑制劑FP-1能夠降低大鼠外周神經損傷所引起的疼痛。已有研究［5］證明加巴噴丁能夠抑制糖尿病大鼠背根神經節 （dorsal root ganglion，DRG） 中TLR4的表達，從而緩解糖尿病大鼠的神經病理性疼痛。本研究探討加巴噴丁對大鼠神經病理性痛的作用及其對DRG中TLR4表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑、動物及分組

TLR4小鼠一抗 （美國Abcam公司）、β-actin抗體 （美國Cell Signaling公司）、 BCA 蛋白分析試劑盒 （中國碧云天公司）。加巴噴丁 （美國Sigma Aldrich公司，CAS編號：60142-96-3） 制備生理鹽水溶液 （50 mg/kg） 供腹腔注射應用。雌性SD大鼠36只，體質量200～220 g，由大連醫科大學附屬第一醫院動物實驗中心提供。正常室溫喂養，照明/黑暗各12 h。動物使用遵照大連醫科大學動物管理委員會要求。大鼠隨機均分為3組：假手術組 （Sham 組）、SNL組和加巴噴丁 （GBP組），每組12只。

1.2 SNL大鼠模型制備及手術操作

SNL組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉 （50 mg/kg） 麻醉后，在左側L4-6沿脊柱切開皮膚，分離肌肉，暴露出L6脊椎橫突，使用4-0醫用縫合線在近段結扎L5脊神經，然后剪斷遠端，最后將肌肉皮膚依次縫合。Sham組大鼠除不結扎L5脊神經，其他操作與SNL組相同。GBP組大鼠的手術操作與SNL組相同，并行手術完成時腹腔注射加巴噴丁 （50 mg/kg）。

1.3 大鼠機械疼痛閾值測定

在術后第1、3、5、7、14天，使用機械縮足閾值 （mechanical withdrawal threshold，MWT） 來測量大鼠機械疼痛程度。將大鼠放在1個有機玻璃盒中 （12 cm×12 cm×16 cm），有機玻璃盒放置于金屬網上 （0.5 cm×0.5 cm）。使用Von Frey絲 （直徑200μm） 垂直扎大鼠的左足底，當大鼠后足突然揚足、縮足或舔足為陽性。刺激間隔8 min，重復5次，計算平均值。

1.4 大鼠熱痛閾值測定

分別在手術前，手術后1、3、5、7 d檢測大鼠后足對熱痛刺激的反應。通過檢測大鼠后足底對熱刺激產生的縮腿動作時間 （thermal withdrawal latency，TWL） 來測量熱痛閾值。將大鼠獨自放在底部厚度為0.2 mm的有機玻璃盒 （18 cm×18cm×36cm） 中，適應環境20 min后，使用熱輻射疼痛刺激器 （BME-410C，天津伯爾尼科技有限公司） 在玻璃板下10 cm聚焦大鼠后足底，當大鼠產生縮足或舔足反應停止照射，記錄起止時間。間隔時間＞8 min，重復5次，取平均值作為TWL。為防止大鼠足底皮膚損傷，設定最高閾值為20 s。

1.5 Western blotting 檢測

術后7 d大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉 （50 mg/kg） 麻醉后，斷頭處死，于冰上快速取L3～5DRG。使用勻漿器，加入蛋白裂解液，將DRG勻漿裂解20 min后，用移液器將蛋白裂解液移至1.5 mL EP管中，4 ℃高速離心15 min后，取上清液，采用BCA法檢測樣品蛋白濃度，用裂解液配平。加入5×上樣緩沖液，煮沸8 min。上樣電泳，濃縮膠80V 40 min，分離膠120 V 80 min，轉膜 100V 60 min，將蛋白轉移到PVDF膜上。5% 脫脂奶粉封閉1 h后，一抗anti-TLR4 （1∶100），anti-β-actin （1∶5 000），4 ℃孵育過夜；室溫TBST洗3次，5 min/次，加入HRP兔抗鼠二抗 （1∶1 000），室溫孵育1 h；TBST洗3次，5 min/次；ECL發光液發光。計算成像后蛋白條帶灰度值。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠MWT、TWL比較

結果顯示，大鼠進行SNL手術前MWT的基礎閾值是20.5 g。與Sham組比較，SNL組、GBP組大鼠手術1、3、5、7 d后MWT持續降低 （P ＜ 0.05），具有時間依賴性；與SNL組比較，GBP組大鼠手術3、5、7 d后MWT明顯升高 （P ＜ 0.05）。見表1。

術前1 d大鼠TWL Sham 組 （12.28±0.8）、SNL組 （11.96±0.7）、GBP組 （12.64±0.8） 比較差異均無統計學意義 （均P ＞ 0.05）。與術前1 d比較，Sham組 （1、3、5、7 d），SNL組和GBP組大鼠 （1，3 d） TWL比較差異均無統計學意義 （P ＞ 0.05）。與Sham組比較，SNL組、GBP組大鼠術后5、7 dTWL均降低 （P ＜ 0.05） ；與SNL組比較，GBP組術后5、7 dTWL升高 （P ＜ 0.05），見表1。

2.2 各組大鼠 Western blotting 檢測結果

結果顯示， Sham組、 SNL組、 GBP組大鼠DRG中TLR4表達分別為1.0±0.0、1.9±0.6、1.2±0.5。與Sham組比較，SNL組TLR4表達明顯增加 （P ＜ 0.01） ；而GBP組TLR4表達無明顯變化 （P ＞ 0.05） ；與SNL組比較，GBP組TLR4表達顯著減少 （P ＜ 0.01）。見圖1。

3 討論

加巴噴丁是一種新型用于治療神經病理性疼痛的藥物，但其緩解疼痛的機制尚不明確。研究［3］表明TLR4在疼痛的產生中發揮重要的作用，TLR4拮抗劑能緩解神經病理性疼痛。有研究［6］表明，TLR4在神經病理性疼痛動物模型中發揮重要作用，與肽類和非肽類DRG初級感覺神經元共表達，并與神經元興奮性的增高相關。TLR4下游信號通路核轉錄因子、P38 MAPK參與痛覺過敏的形成過程［7］。

本研究結果顯示，結扎L5脊神經能夠激活TLR4 相關的痛覺敏化通路，表明TLR4在SNL引起疼痛中起著重要的作用。SNL大鼠DRG中TLR4表達增加，TLR4可能與SNL誘發的疼痛相關，加巴噴丁可以降低DRG中TLR4表達，有可能通過阻斷TLR4的下游通路發揮緩解疼痛的作用，其可能機制是在大鼠神經病理性疼痛的模型中，通過抑制TLR4下游的MyD88依賴性信號通路來緩解神經病理性疼痛［8］。另有研究［9-10］表明脊髓中ANXA0/NF-kB/MMP-9信號通路與前炎癥細胞因子活化在SNL誘導的神經病理性疼痛中發揮重要作用；SNL （L5結扎） 模型L5DRG中Nav1.7蛋白表達降低［10］。

綜上所述，加巴噴丁能夠緩解神經病理性疼痛，降低SNL大鼠DRG中TLR4表達。TLR4是天然免疫反應的第一道防線，其下游具有復雜的信號通路，加巴噴丁如何影響信號通路仍不清楚，需要進一步研究論證。