禽法氏囊、腺病毒二聯滅活疫苗的制備與檢驗

吳衛東 魏中鋒 徐梅 岳立

（1，山東省菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院 274000；2，山東省菏澤市動物疫病預防控制中心 274000）

雞傳染性法氏囊病是一種重要的雞免疫抑制病［1］，目前國內同時存在經典毒株、變異毒株和超強毒株，經常導致雞群的免疫失敗，給禽業養殖造成重大的損失［2］。為了有效防治雞傳染性法氏囊病制備了法氏囊、腺病毒二聯油乳劑滅活疫苗，經過試驗檢驗有效性良好。

1 材料

1.1 毒株

禽法氏囊、腺病毒疫苗毒株由本實驗室分離鑒定的當地流行毒株。

1.2 試驗動物

SPF 雞胚、SPF 雞購自山東農業科學院SPF 雞場。

1.3 主要試劑

注射用白油購吉化江城油脂化工有限責任公司；硬脂酸鋁、司本-80、吐溫-80 均購自湖北江民泰華化工有限公司湖北江民泰華化工有限公司。

1.4 主要儀器

型號為FSH-2 可調高速電動勻漿器購自金壇市天竟實驗儀器廠。

2 制備方法

2.1 病毒抗原的制備與檢驗

2.1.1 種毒增殖

將禽法氏囊、腺病毒疫苗毒株分別用滅菌0.9%生理鹽水1000 倍稀釋后，通過卵黃囊接種 7～9日齡 SPF 雞胚 200 枚，0.2ml/胚，SPF 雞胚必須是經檢測無禽法氏囊、腺病毒感染史和免疫史，37℃孵育48～120h，在此過程中無菌收集死亡雞胚的尿囊液，存放于-20℃保存。

2.1.2 種毒含量的測定

將種毒增值后的尿囊液用滅菌生理鹽水依次進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 倍稀釋，取每個稀釋度的病毒液經卵黃囊途徑分別接種7～9日齡SPF 雞胚16枚，接種量為0.1ml/胚，將接種的雞胚置于37℃按照孵化技術孵育168h，進行每天記錄死亡雞胚數量，按照Reed-Muench法計算增值種毒液對SPF 雞胚的半數致死量（ELD50）。

2.1.3 種毒液滅活

將增殖后的種毒液加入最終含量為0.1%甲醛攪拌均勻后，放置于60℃水浴鍋中滅活3h，種毒液經甲醛滅活后置2～4℃保存備用。

2.2 滅活疫苗的制備

2.2.1 油相制備

取注射用白油94 份，硬脂酸鋁1 份，加熱緩慢攪拌至完全融化，再加入司本-80 6 份，充分攪拌混勻后再116℃高壓滅菌 30min，放置于 2～8℃保存。

2.2.2 水相制備

取高壓滅菌好的吐溫-80 4 份，法氏囊、腺病毒滅活抗原各48 份，混合加入，低速攪拌至兩者完全溶解，置于2～8℃保存。

2.3 滅活疫苗的實驗室質量檢驗

2.3.1 物理性狀檢驗

（1）肉眼仔細觀察滅活疫苗的顏色和性狀。

（2）黏度檢驗，將 2～8℃保存的疫苗取出逐漸恢復至室溫25℃左右，用1ml 吸管吸取制備的疫苗1.0ml，使其從吸管中垂直流出，記錄流出0.4ml 所用時間是否達到標準。

2.3.2 制備疫苗的效力試驗

（1）疫苗抗體效價的測定將30 只21日齡SPF 雞隨機分成3 組（對照組、低免疫組、高免疫組），每組 10 只，低免疫組、高免疫組分別在頸部皮下注射滅活疫苗0.2ml 和0.5ml，對照組注射滅菌生理鹽水 0.5ml，在注射疫苗 1 周、2 周、3 周、4 周、2月、4月、6月后對各組的雞于進行翅靜脈處采血，每只雞采血0.5ml，用離心機分離血清。將分離的血清做2 倍的梯度倍比稀釋，用10 倍濃縮的法氏囊、腺病毒滅活種毒作為檢測抗原，用瓊脂擴散的免疫學檢測方法測定每組雞的抗體效價，用數據分析軟件進行各組試驗雞數據方差分析和多重比較。

（2）攻毒保護試驗。將購買的 21日齡 SPF 雞 20 只隨機分成 2 組（對照組、試驗組），每組 10 只，試驗組每只雞在頸部皮下注射制備好的滅活疫苗0.5ml，對照組每只雞注射滅菌生理鹽水0.5ml。在注射21d 后采集對照組、試驗組每只雞翅靜脈血0.5ml，離心分離血清，采用瓊脂擴散方法測定每只雞的血清抗體效價，然后對所有雞點眼接種未滅活的法氏囊病毒液和肌肉注射未滅活的腺病毒液，接種量為0.1ml/只，在攻毒后每日記錄每只雞的臨床癥表現和發病死亡情況，對死亡的雞解剖檢驗，記錄病理變化，在攻毒14d 后將所有活雞進行解剖檢驗，記錄病理變化。

3 結果

3.1 疫苗種毒病毒含量測定結果

按Reed-Muench 法計算法氏囊、腺病毒液的病毒含量ELD50 分別為 10-5.53/0.1ml 和 10-6.17/0.1ml，表明疫苗種毒病毒液中的病毒含量較高。

3.2 種毒抗原滅活檢驗結果

經甲醛滅活后的法氏囊、腺病毒抗原接種7日齡SPF 雞胚0.1ml/胚，37℃孵育 168h 后，檢查雞胚無死亡，剖檢雞胚未出現任何病變，將孵育168h 雞胚的尿囊液盲傳3 代后也未發現雞胚死亡和剖檢病變，表明種毒抗原病毒液滅活徹底安全。

3.3 疫苗臨床安全性檢驗結果

14日齡20 只SPF 雞在注射疫苗后，臨床觀察未出現任何異常情況，如減食、腹瀉、呼吸道炎癥等。在 14d 后，所有存活雞解剖后，觀察注射部位，注射疫苗已全部吸收，未產生疫苗吸收不良或炎癥情況。

3.4 疫苗效力試驗結果

3.4.1 瓊脂擴散檢測結果

在疫苗免疫后每周進行采血檢測，試驗組的抗體效價（log2）與對照組相比均顯著提高（P＜0.05）。在疫苗免疫后第一周和第二周的抗體效價（log2）差異均顯著（P＜0.05），在第四周后疫苗免疫每周采血檢測抗體結果差異均不顯著（P＞0.05）。低免疫組、高免疫組抗體效價均能在免疫28d 后的達到最高值，在維持2個月后才會出現緩慢下降情況，在注射疫苗4個月后，疫苗注射組的抗體效價仍能保持在4log2 以上。在注射疫苗6個月后，疫苗注射組的抗體效價仍處在3log2 以上。

3.4.2 SPF 雞攻毒保護試驗結果

在攻毒3d 后，對照雞先后出現發熱、精神萎靡、拉黃綠糞便等臨床癥狀，7d 后所有對照組雞全部死亡，解剖可見心包積液、肝臟腫大、腺胃乳頭出血、法氏囊腫大出血、腿肌胸肌出血等法氏囊和腺病毒感染的典型病理變化。疫苗免疫組雞免疫后3 周后采血檢測法氏囊和腺病毒抗體效價平均值為4.40log2 和 4.52 log2，對照組為 0log2，在攻毒后 3 周內未出現死亡，結果表明，制備的滅活疫苗能完全保護法氏囊和腺病毒強毒株的攻擊，滅活疫苗的免疫效果較好。

4 小結

禽法氏囊和腺病毒對目前雞養殖業已造成重大危害，尤其在有些地區還存在禽法氏囊和腺病毒混合感染的情況，本試驗以本地分離流行毒株為疫苗種毒，成功制備出了法氏囊、腺病毒二聯油乳劑滅活疫苗，并經過實驗室質量檢驗符合國家獸藥典標準。