苗藥黑骨藤研究進展△

楊波，張建鋒

國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550009

黑骨藤是貴州苗族地區常用藥物之一，其味苦、辛，性溫，有小毒；具有祛風除濕、活血消癰之功效，常用于治療跌打損傷、風濕痛、骨折等。黑骨藤為蘿摩科植物西南杠柳PeripocaforrestiiSchltr.的根或全株。該種主要分布于貴州、云南、西藏等，在其他民族也有藥用，《廣西藥用植物名錄》(鐵散沙、牛尾蕨、鐵骨頭、山筋線)、《貴州草藥》(黑骨頭、柳葉過山龍)、《昆明民間常用草藥》(山楊柳、青蛇膽、小青蛇、柳葉夾)、《云南中草藥選》(飛仙藤、達風藤)、《云南中草藥》(小黑牛、青香藤、奶漿藤、青色丹、青風藤)等中均有藥用記載[1]。關于黑骨藤已有較多研究報道，本文對其提取工藝、化學成分、質量控制、藥理作用等研究概況進行綜述，為其進一步研究和開發利用提供參考。

1 提取工藝研究

賈荷麗等[2]對苗醫藥的復方黑骨藤提取工藝進行研究，以總生物堿得率和干膏得率的綜合評分為指標，采用正交設計考察了乙醇體積分數、固液比、提取時間、提取次數等參數。確定最佳提取工藝為藥材粗粉加6倍量70%乙醇提取3次，每次1 h。最終優選的提取工藝穩定可行，用于制備復方黑骨藤新制劑。袁德彬等[3]以杠柳苷提取率為指標，采用正交試驗優選提取工藝參數。確定的最佳工藝條件：溶劑為50%乙醇，料液比為1∶15，功率為800 W，溫度為50 ℃，提取2次，每次20 min。此工藝合理可行，適用于黑骨藤中杠柳苷的提取。周秋月等[4]以黑骨藤中杠柳苷、秦艽中龍膽苦苷和元胡中延胡索乙素為檢測指標，采用HPLC 考察3 種大孔樹脂(D-101、AB-8、NKA-9)對杠柳苷、龍膽苦苷和延胡索乙素的吸附分離性能，并考察分離純化杠柳苷、龍膽苦苷和延胡索乙素成分的最佳工藝條件。結果顯示，采用大孔樹脂 D-101對復方黑骨藤藥物中杠柳苷、龍膽苦苷和延胡索乙素成分進行分離、純化為好，可作為復方黑骨藤藥物質量控制方法。陳坤等[5]采用D-101型大孔樹脂，以總萜、總黃酮和總生物堿的轉移率評價上樣質量濃度、上樣量、吸附時間和洗脫液體積流量對純化效果的影響，以落干酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、杠柳苷、延胡索乙素、四氫小檗堿和延胡索甲素的轉移率評價洗脫液濃度對純化效果的影響，以延胡索甲素的轉移率確定洗脫終點，最終優化出最佳純化工藝條件，該純化工藝穩定可行，可作為黑骨藤復方藥物有效部位制備工藝。

2 化學成分研究

據文獻報道，黑骨藤根莖中含有杠柳苷、杠柳苷元、8-羥基杠柳苷元和滇杠柳苷，還含胡蘿卜苷、熊果酸、北五加皮苷等成分。張宏等[6]首次利用HPLC測定不同產地黑骨藤中杠柳苷的含量，建立了HPLC測定黑骨藤中杠柳苷的方法，并用于不同產地黑骨藤中杠柳苷的測定，具有簡便快速的特點，為黑骨藤藥材的質量標準建立提供參考依據。徐宏等[7]采用反相高效液相色譜法測定黑骨藤中滇杠柳苷Ⅰ的含量，發現骨藤中滇杠柳苷Ⅰ對多種腫瘤細胞具有顯著的細胞毒活性，可將該成分作為黑骨藤質量控制的指標成分，對提高黑骨藤的質量控制水平提供了一定的依據。采用多種柱色譜及制備型 HPLC 等方法進行分離純化，并運用現代波譜學方法，如理化分析、核磁共振和質譜等鑒定其結構，對黑骨藤的化學成分進行研究。在黑骨藤70%乙醇提取物中分離得到19個化合物中，其中化合物 16種為首次從該屬植物中分離得到，化合物4種為首次從該植物中分離得到[8-9]。趙超等[10]采用反復硅膠柱色譜法、Sephadex LH-20柱色譜法等進行分離純化，并通過理化常數測定和質譜、一維、二維核磁共振等波譜方法分析鑒定其化學結構，研究黑骨藤化學成分。從黑骨藤中分離鑒定了2個神經酰胺類化合物，分別為1-O-β-D-葡萄糖-(2S，3S，4R，10E)-2-[(2R)-2-羥基二十四烷酰氨基-10-十八烷-3，4-二醇(1)，(2S，3S，4R，10E)-2-[(2R)-2-羥基二十四烷酰氨基]-10-十八烷-1，3，4-三醇(2)。所有化合物均首次從黑骨藤中分離得到，采用二維核磁技術確定化合物2的結構，并對其二維譜數據進行歸屬。

3 質量控制研究

質量控制研究包括建立質量標準、多指標定量測定、質量分析等諸多內容，徐宏[11]以對多種腫瘤細胞具有顯著細胞毒活性的滇杠柳苷和專屬性很強的新化合物羽扇豆烷壬酸酯作為指標成分，采用HPLC和薄層色譜掃描法(TLCS)建立其含量測定方法，為進一步提升黑骨藤質量標準提供實驗依據并制定黑骨藤的質量標準(草案)。同時，對苗藥黑骨藤的指紋圖譜進行探索性研究，在其有效成分不完全明確的前提下，以作為黑骨藤質量控制的輔助手段，為提高黑骨藤的質量控制水平和科技含量提供依據。王文春等[12]采用高效液相色譜法，對不同產地黑骨藤藥材中槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷的含量進行測定，結果有明顯差異，初步說明濕度、產地、光照等因素均對黑骨藤中該成分的含量有影響。胡茜等[13]采用響應面法優化液相色譜條件，同時通過響應面法對黑骨藤指紋圖譜液相色譜方法進行研究，并得到優化黑骨藤的色譜分析條件：Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水，梯度洗脫，時間為50 min，流速為1.5 mL·min-1，柱溫為50 ℃。利用響應面法成功對黑骨藤指紋圖譜的液相色譜條件進行優化。徐艷等[14]采用HPLC 同時測定復方黑骨藤中落干酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、龍膽苦苷、獐芽菜苷、杠柳苷、延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素9 種有效成分的含量。使用Kromasil C18色譜柱，通過調節波長進行檢測，在波長206 nm成分為延胡索乙素、四氫小檗堿、延胡索甲素，波長225 nm成分為落干酸和杠柳苷，波長243 nm成分為獐牙菜苦苷和獐牙菜苷，波長275 nm成分為6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷和龍膽苦苷。其中，落干酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、龍膽苦苷、獐芽菜苷、杠柳苷、延胡索乙素、四氫小檗堿和延胡索甲素的質量濃度在一定范圍內與峰面積呈良好的線性關系；經方法學驗證，本方法可用于黑骨藤復方藥物中9 種有效成分的分析和含量測定，為復方黑骨藤藥物的質量控制奠定基礎。李琪等[15]建立了對復方黑骨藤提取物中龍膽苦苷、延胡索乙素和杠柳苷3 種成分的含量進行測定的分析方法，本實驗分別對色譜條件和樣品的前處理進行考察，在最佳的實驗條件下對復方黑骨藤中的龍膽苦苷、延胡索乙素和杠柳苷3 個成分同時進行反相高效液相色譜(RP-HPLC)的分析。確定該分析方法對于樣品前處理簡單易行、準確性高、重復性好、實用性強，達到了實驗預期目的，為后續復方黑骨藤的質量控制打下良好的基礎。

4 藥理作用研究

在風濕性關節炎及類風濕性關節炎等疾病的治療中，苗藥黑骨藤被廣泛應用，其生物活性主要有鎮痛、抗炎及強心作用，除此還具有抗癌作用。冉啟軍等[16]采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠致大鼠足趾腫脹2種動物模型，檢測黑骨藤總黃酮的抗炎作用；采用小鼠熱板法鎮痛實驗及冰醋酸致小鼠扭體反應模型檢測其鎮痛作用。結果表明，黑骨藤總黃酮具有較好的抗炎消腫與鎮痛作用，提示其黃酮類成分可作為黑骨藤藥材的指標性成份。梁勇等[17]通過對黑骨藤抗腫瘤活性成分進行篩選，并對其化學成分進行提取分離，發現質量濃度在25 mg·L-1時，黑骨藤乙酸乙酯部位對白血病K562抑制率可達到80.71%。從該部位分離所得化合物Ⅵ和化合物Ⅸ在10 mg·L-1質量濃度下腫瘤抑制率分別達到97.48%、40.56%。揭示苗藥黑骨藤抗腫瘤活性的有效成分、有效部位和作用機制，為黑骨藤在抗腫瘤方面的研究、開發和利用奠定堅實的理論基礎。甄茹等[18]采用維生素D3誘導兔骨髓細胞法獲得破骨細胞，以形態學觀察蘇木素、伊紅染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鑒定破骨細胞，通過測定黑骨藤各極性部位不同劑量對破骨細胞TRAP酶活力，根據TRAP+細胞計數及骨吸收陷窩面積的影響來確定活性部位，從而研究黑骨藤對破骨細胞分化的影響。最終確定黑骨藤主要活性部位是乙酸乙酯部位，它可以抑制骨髓細胞向破骨細胞分化及骨吸收能力。李慧敏等[19]將黑骨藤 95%乙醇提取物分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑進行萃取，把乙酸乙酯萃取物用硅膠層析法進行分離，研究黑骨藤中抗類風濕性關節炎的有效成分。把各分離物進行小鼠耳廓腫脹和大鼠足腫脹實驗，并測定各分離物中總黃酮和總皂苷的含量。黑骨藤醇提物乙酸乙酯萃取物的三氯甲烷-甲醇(5∶1)片段的抗炎作用最好，進一步研究發現，黑骨藤分離物中總黃酮和總皂苷的含量越高其抗炎作用越強。王恒等[20]將成年雄性SD大鼠120只分為4組，分別為假手術組(A組)、模型組(B組)、黑骨藤10 mg·kg-1組(C組)、黑骨藤20 mg·kg-1組(D組)，每組30只。研究黑骨藤乙醇提取物對大鼠坐骨神經鉗夾損傷的作用及可能的作用機制。B、C、D組大鼠進行坐骨神經損傷(SNI)手術，A組僅暴露游離坐骨神經，術后每日分別給予0.90%氯化鈉(A、B組)或相應劑量的黑骨藤乙醇提取物(C、D組)灌胃。各組分為3個時間點測定坐骨神經功能指數(SNI)；取坐骨神經，進行HE染色，觀察大鼠坐骨神經的組織形態學變化；取股動脈血，ELISA法檢測各組大鼠血清中白細胞介素和腫瘤壞死因子的表達水平。黑骨藤乙醇提取物可改善大鼠SNI，其作用機制可能與抑制免疫炎癥因子有關。王霞等[21]采用50 μg·mL-1TNF-α活MH7A細胞，研究黑骨藤中分離得到的8個咖啡酰基奎寧酸類單體化合物抑制人類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞(MH7A)增殖的作用，并對其活性較好的2個化合物進行可能的分子機制研究。發現黑骨藤中咖啡?；鼘幩犷惢衔锞哂休^好的抗類風濕性關節炎活性，其作用機制可能與抑制MAPK信號通路的激活，降低NF-κB 活性，抑制下游炎癥因子表達，進而減輕炎癥反應有關。

5 臨床應用研究

對黑骨藤提取物和黑骨藤制劑的臨床應用已有研究報道。張貴源等[22]通過實驗發現，黑骨藤可使線蟲被損傷的神經恢復功能，揭示黑骨藤在治療神經退化性疾病方面的價值。PC12細胞被廣泛用于神經保護作用藥物篩選研究，在使用H2O2氧化損傷之前，PC12細胞先接受黑骨藤乙醇提取物的藥物作用，可提升PC12細胞的存活率，說明黑骨藤具有抗氧化損傷作用。黑骨藤既具有神經保護作用又具有抗氧化作用，具有開發成治療神經退化性疾病藥物的潛能，為進一步探索黑骨藤的新用途提供了參考。黃明進等[23]觀察黑骨藤提取物對AA 大鼠足腫脹、體質量、器官指數及血清與炎性組織液中白介素-1β(IL-6)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量水平的影響，結果表明黑骨藤提取物能有效下調胸腺指數、抑制AA 大鼠足腫脹、降低AA 大鼠血清與炎性組織液中IL-6IL-1β、TNF-α、IL-6的含量水平。黑骨藤具有良好的抗類風濕關節炎(RA)作用，其作用機制可能與調節免疫器官功能及促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量水平有關。張鷹等[24]采用磺酰羅丹明B比色法和網絡藥理學考察苗藥黑骨藤抗肺癌活性部位，并對西南地區苗藥黑骨藤防治肺癌的分子機制進行研究。通過文獻查閱篩選出黑骨藤中與肺癌相關的活性成分。黑骨藤抗肺癌活性成分共42個，活性成分與疾病作用的關鍵靶點53個，GO富集分析顯示，黑骨藤作用于肺癌的關鍵節點為EGFR、GRB2、P53、NF-kB；信號通路主要富集在細胞增殖、凋亡、應激及泛素介導的水解、MAPK等16條信號通路。進一步證明黑骨藤抗肺癌可能是通過PI3K-AKT和MAKB信號通路發揮作用。莫禮華等[25]觀察隔苗藥黑骨藤追風液紙火法治療急性期肩周炎的臨床療效，治療60例急性期肩周炎。臨床治愈38例，顯效12例，有效10例，無效1例，總有效率96.9%，其中1個療程治愈40例，2個療程治愈11例，顯效9例。隔苗藥黑骨藤追風液紙火法治療急性期肩周炎果明顯，療效確切。張兆奎等[26]采用隨機、對照臨床試驗的方法，將60例膝骨性關節炎患者隨機分為隔苗藥黑骨藤追風液紙火法組(治療組)和熱奄包組(對照組)。研究苗藥黑骨藤追風液治療膝骨性關節炎的臨床療效，并運用膝骨性關節炎治療效果判定標準(JOA)進行臨床評分，比較兩組臨床療效。對比發現，治療組臨床療效優于對照組，治療組在用藥過程中未見不良反應。隔苗藥黑骨藤追風液紙火法治療膝骨性關節炎是一種安全有效的方法。梁江等[27]觀察黑骨藤乙醇提取物對人類風濕關節炎滑膜成纖維細胞的增殖以及環氧化酶-2、前列腺素2的表達影響。離體培養第4 代的人類風濕關節炎滑膜成纖維細胞，同時設立空白對照組和實驗組，兩組細胞均先予白介素-1β干預刺激，實驗組予不同質量濃度的PFE(125、250、500 μg·mL-1)干預細胞，24 h 后，采用MTT法檢測細胞抑制率。用實時定量熒光PCR(RT-PCR)法測定COX-2的mRNA表達。免疫蛋白印記(WB法)檢測COX-2的表達量，ELISA法檢測48 h末，細胞培養上清中PGE2的含量，干預48 h后，PFE對細胞抑制率呈量效正相關性，各劑量組的PFE對PGE2、COX-2 mRNA及其蛋白的表達量有明顯抑制(P<0.05)，PFE能抑制IL-1β誘導的RASF 增殖，在mRNA和蛋白兩個層面均對RASF高表達的COX-2有明顯抑制效果，同時對該細胞分泌的炎癥效應分子PGE2也有抑制作用，這可能是黑骨藤治療類風濕關節炎的潛在機制之一。

6 展望

近年來，隨著黑骨藤的應用越來越廣泛，部分研究學者對黑骨藤資源學、分子生藥學、提取方法、化學成分、生物活性和臨床應用等方面進行深入細致的研究，研制出以黑骨藤為主藥的系列產品，包括：黑骨藤追風活絡膠囊、黑骨藤追風液、黑骨藤伸筋透骨液、黑骨藤傷濕帖、復方仙靈風濕酒、生龍驅風藥酒、楓荷除痹酊等品種。在臨床對風濕病、類風濕病的治療方面，黑骨藤及其復方制劑具有良好的治療效果和應用價值，彰顯良好的發展潛力。對苗藥黑骨藤進行全面、細致、深入研究和開發尤為重要，讓其進一步標準化、規范化進行種植和管理，使之朝著產業化方向快速發展。