鮮藥質量評價研究進展*

錢正明 ，李文慶 ，黃 琦 ，金李玲 ，李文佳 ，梅全喜

（1.廣東東陽光藥業有限公司·國家中醫藥管理局重點研究室，廣東 東莞 523850； 2.湘南學院，湖南 郴州 423000； 3.廣東省深圳市寶安純中醫治療醫院，廣東 深圳 518101）

鮮藥是指采挖后新鮮使用的中藥材，具有活性成分保留充分和藥效好的優勢，在我國應用歷史悠久［1］。《神農本草經》記載“地黃生者尤良，此生者實為鮮品”，《傷寒論》中生姜瀉心湯以生姜入藥，《肘后備急方》用鮮青蒿治療瘧疾［2］。近年來，鮮藥在中醫藥臨床和健康保健中發揮了重要作用，如鮮石斛、鮮龍葵、鮮冬蟲夏草和鮮人參等廣泛應用于實際生活。鮮藥研究已成為中藥科研領域的研究熱點，國內外對鮮藥應用歷史、保鮮技術、化學成分、藥理臨床和鮮藥制劑等作了總結［3］。質量評價研究是保障鮮藥產業穩步發展的關鍵，同時也是鮮藥科學研究的重點。近年來，隨著分析技術的發展，鮮藥質量評價方法也在不斷進步，本研究中結合國內目前鮮藥的質量標準和近年來發表的鮮藥質量評價技術文獻進行總結和分析，為未來鮮藥的科學研究提供參考。

1 鮮藥質量標準概況

現行的鮮藥質量標準主要包括中國藥典標準和地方藥材標準。2015年版《中國藥典（一部）》收錄鮮藥標準共7個，其中鮮藥單獨建立標準的品種有2個，即生姜［4］101和牡荊葉［4］172-173；與干品共同建立標準的品種有 5個，即鮮地黃［4］124-125、鮮蘆根［4］164、鮮石斛［4］92-93、鮮益母草［4］290-291和鮮魚腥草［4］224。其中生姜、鮮地黃藥材標準質量評價項目比較完善，生姜包括性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、總灰分檢查和含量測定；鮮地黃包括性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、總灰分及酸不溶性灰分檢查和浸出物測定。而其他鮮藥標準質量評價項目較少，如鮮魚腥草、鮮益母草和牡荊葉僅對藥材性狀和顯微鑒別進行了規定，缺少檢查、含量測定項。

《中國藥典（一部）》收載鮮藥品種數量有限，難以滿足鮮藥臨床實際應用的要求，為保障鮮藥的質量，各地方根據該省用藥習慣建立了相應的鮮藥標準進行藥材質量評價。目前，各省市中藥材地方標準及中藥飲片炮制規范共收錄鮮藥80多種，其中上海市中藥飲片炮制規范中收錄最多，有 23 種，包括何首烏［5］92-94、荷葉邊［5］508、景天三七［5］311、鮮石菖蒲［5］318、鮮石斛［5］405和鮮鐵扁擔等［5］507。地方鮮藥材質量標準的建立對鮮藥的臨床應用和產業發展起到了很好的保障作用。但地方鮮藥材質量標準研究不深入、質量評價項目不完善，如荷葉邊、鮮鐵扁擔只規定了來源，無檢測項目，何首烏、鮮石菖蒲只有性狀檢測項目［5］。

2 鮮藥真偽鑒別

2.1 性狀鑒別

性狀鑒別是指對藥材宏觀性狀（形狀、大小和顏色等）和感官特征（質地、氣味和味道）進行鑒別。《中國藥典（一部）》中生姜的性狀記載：“本品呈不規則塊狀，略扁，具指狀分支，長4～18 cm，厚1～3 cm，表面黃褐色或灰棕色，有環節，分支頂端有莖痕或芽。質脆，易折斷，斷面淺黃色，內表皮環紋明顯，維管束散在。氣香特異，味辛辣。”該性狀規定藥材在形狀、大小、色澤和質地等方面充分突出了鮮藥的特點：生姜較干姜體積更大，體型飽滿，略扁（干姜為扁平）；生姜斷面色為淺黃色，而干姜斷面色為黃白色或灰白色；鮮姜質脆，易折斷，而干姜質堅實。冬蟲夏草鮮品相對于干品形態更飽滿，特別是子座部分多呈圓柱形，而干品子座多干癟；另外，鮮品較干品質地稍柔韌（干品質脆），氣味較干品淡一些［6］。

電子感官評價技術也逐漸在鮮藥性狀鑒別研究中應用。劉紅秀等［7］采用電子鼻系統PEN3結合數學統計分析法，建立了廣藿香藥材、新鮮廣藿香、薄荷藥材及新鮮薄荷4種中藥材的氣味指紋圖譜，能很好地鑒別不同類中藥材及其不同新鮮度，為鮮藥性狀鑒別提供了數字化評價方法。

2.2 顯微鑒別

顯微鑒別是利用顯微鏡對藥材的組織、細胞等微觀特征進行分析的鑒別技術。鮮藥因新鮮狀態利于切片不易粉碎的特點，因此多采用切片鑒別。中國藥典中收錄的7種鮮藥中5種鮮藥材（鮮地黃、牡荊葉、鮮益母草、鮮石斛、生姜）均采用切片顯微鑒別，如鮮益母草通過其表皮細胞、下皮厚角細胞、皮層、韌皮部、木質部、髓部、薄壁細胞的特征鑒別；生姜通過其橫切面的木栓層、皮層、中柱及薄壁組織特征鑒別。鮮藥標準中也有少部分藥材采用粉末鑒別，操作方式一般為干燥后粉碎，粉末鑒別同干品，如鮮魚腥草，藥典標準就采用了粉末鑒別，其主要粉末顯微鑒別特征為油細胞、非腺毛、腺毛、葉表皮細胞和草酸鈣簇晶。

2.3 DNA分子鑒定

DNA分子鑒別是利用藥材基因組中一段相對較短的DNA片段進行真偽鑒定的一種分析技術。聚合酶鏈式反應（PCR）是DNA分子鑒別技術的一種方法，具有快速、簡便、高效等特點。《中國藥典》中烏梢蛇和川貝母標準采用該方法作為藥材鑒別方法。李文慶等［8］采用PCR技術建立了鮮冬蟲夏草的DNA分子鑒別方法，該方法基于內轉錄間隔區2（ITS2）序列設計的特異性引物（正向 5′-AGTTACCACTCCCAAACC-3′和反向 5′-TGCTTGCTTCTTGACTGA-3′），首先通過植物基因組DNA試劑盒提取DNA；再進行PCR擴增：94℃預變性5 min，循環反應 30 次（94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），延伸（72℃）5 min；最后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析檢測。該方法通過對實際樣品的檢測，可有效鑒別蝙蝠蛾擬青霉菌絲體、蛹蟲草、蟬花、亞香棒蟲草、新疆蟲草、涼山蟲草和戴氏蟲草等冬蟲夏草混淆品。

2.4 波譜鑒別

紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜和質譜是常用的波譜技術，在中藥鑒別中均有運用。其中，紅外光譜具有簡便、快捷和特征性強的優點，被大量應用于中藥材的鑒別分析。有人建立了鮮冬蟲夏草紅外特征圖譜鑒別技術，將鮮冬蟲夏草干燥后粉碎，與溴化鉀粉末混合，于紅外燈下在瑪瑙乳缽中研磨均勻，壓成透明薄片，于紅外光譜儀中進行測試，得其紅外光吸光圖譜，確定了7個特征峰（分別為 2926 cm-1，2855 cm-1，1746 cm-1，1652 cm-1，1546 cm-1，1084 cm-1，931 cm-1）。通過比較特征峰的方法發現，蟬花、蛹蟲草、中華被毛孢菌絲體、亞香棒蟲草、戴氏蟲草這5種冬蟲夏草混淆品均存在特征峰的缺失情況，該方法可有效鑒別鮮冬蟲夏草和其混淆品［9］。

2.5 薄層色譜鑒別

由于鮮藥對照藥材不易長時間儲存，薄層鑒別時多采用對照品進行對照鑒別。生姜薄層色譜鑒別，直接將生姜處理成小塊后，采用乙酸乙酯提取，以6-姜辣素作對照品，采用硅膠G薄層板，以石油醚（60～90℃）-三氯甲烷 -乙酸乙酯（2∶1∶1，V/V/V）為展開劑，以香草醛硫酸試液為顯色劑進行鑒別。鮮冬蟲夏草薄層色譜鑒別法，將鮮品干燥粉碎，采用90%甲醇提取，以腺苷和尿苷作對照，采用4%磷酸氫二鈉溶液浸漬后的硅膠GF254薄層板，以異丙醇-乙酸乙酯-甲醇-水-濃氨試液（5 ∶3 ∶1 ∶1 ∶0.1，V/V/V/V/V）為展開劑，紫外光燈（254 nm）下檢視。該方法可有效鑒別中華被毛孢菌絲體、蝙蝠蛾擬青霉菌絲體、蛹蟲草、亞香棒蟲草、新疆蟲草和涼山蟲草［8］。

2.6 特征圖譜鑒別

中藥特征圖譜鑒別技術是指藥材經過處理后，采用色譜儀器分析，得到能體現藥材特征色譜峰的圖譜，并用于藥材的真偽鑒別，見于中國藥典品種羌活、沉香等中藥材標準，但在鮮藥材標準中尚未見收錄。李文慶等［8］采用高效液相色譜技術建立了鮮冬蟲夏草的特征圖譜，確定了6個特征色譜峰，通過分析40批鮮冬蟲夏草和8批蟲草混淆品，可有效鑒別中華被毛孢菌絲體、蝙蝠蛾擬青霉菌絲體、蛹蟲草、蟬花、亞香棒蟲草、新疆蟲草和涼山蟲草。同時，采用高效液相色譜-質譜聯用技術建立鮮冬蟲夏草蛋白類成分特征圖譜，確定鮮冬蟲夏草的6個特征蛋白峰，可有效鑒別蛹蟲草、蟬花、草石蠶、亞香棒蟲草、涼山蟲草、中華被毛孢菌絲體和蝙蝠蛾擬青霉菌絲體［10］。

氣相色譜常用于藥材揮發性成分的分析。李計萍等［11］采用水蒸氣蒸餾法得到鮮、干姜的揮發油成分，并建立了氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）法對二者成分進行了比較。測定結果顯示，生姜檢測出77個峰，鑒定出37個成分；干姜檢測出83個峰，鑒定出44個成分，并從中尋找到了2個生姜中的特有成分，即β-欖香烯和反，反-法呢醛。采用GS-MS法對鮮冬蟲夏草中的揮發性成分進行了研究，鑒定出15個揮發性成分，可為冬蟲夏草鮮品的鑒別提供參考［12］。

3 鮮藥含量測定

3.1 紫外分光光度法

紫外分光光度法作為中藥質量評價的常用檢測技術，具有操作方便、檢測速度快的特點，主要應用于藥材中某一類成分的含量測定。李計萍等［13］采用紫外分光光度法比較了鮮地黃與干地黃中多糖的含量，先用80%乙醇去除小分子糖，然后用水回流提取樣品多糖，硫酸-苯酚法反應，檢測波長為480 nm，結果顯示，鮮地黃中的多糖含量（以干品計）為7.81% ～9.48%，而干地黃中的多糖含量為4.21% ～4.46%，地黃鮮品多糖含量約為干品的2倍。該結果驗證了“地黃生者尤良”的合理性，同時也提示多糖作為地黃的重要活性成分，在鮮干地黃標準含量限度設定應有區別。

3.2 高效液相色譜法

鮮藥所含成分復雜，分離純化難度大，高效液相色譜法具有分離能力強、分析速度快、檢測靈敏度高的特點，是目前鮮藥中常用的含量測定技術。劉秋瓊等［14］采用高效液相色譜法對經保鮮處理的鮮龍葵果和干龍葵果中的抗腫瘤成分澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量進行了比較，結果顯示，經保鮮技術處理的鮮果中澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的含量比干果的含量高80%以上，說明龍葵果在干燥過程中生物堿存在流失。王夢溪等［15］采用高效液相色譜法測定益母草鮮品和干品中生物堿和黃酮類成分含量，結果顯示，鮮品中生物堿（水蘇堿和益母草堿）和黃酮（槲皮素和芫花素）的含量均明顯高于干品，說明干燥過程會引起益母草生物堿及部分黃酮類成分的損失。李文慶等［16］采用高效液相色譜蒸發光散射檢測器聯用技術建立了冬蟲夏草中3種甾醇類成分（麥角甾醇、膽甾醇和谷甾醇）的測定方法，并對冬蟲夏草干品和鮮品進行比較，結果鮮冬蟲夏草繁育品與干冬蟲夏草繁育品甾醇含量相當，提示干冬蟲夏草采用低溫冷凍干燥技術很好地保留了鮮冬蟲夏草中原有甾醇類成分。

3.3 氣相色譜法

氣相色譜技術多用于藥材中揮發性成分的定量分析。何剛等［17］采用GC-MS法建立了鮮魚腥草中4種揮發油類成分（4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯和甲基正壬酮）的定量方法，結果顯示，采收期不同，魚腥草鮮藥材揮發油中4種揮發性成分的含量差異較大。其次，生代謝產物的積累隨時間推移，4種成分含量呈上升趨勢，到8月中旬含量最高，此后含量下降。

4 鮮藥有害物質測定

有害物質測定是鮮藥質量評價的重要組成部分，目前，鮮藥質量主要涉及的有害物質包括重金屬和農藥殘留。

重金屬常見測定技術包括比色法、原子吸收光譜法和電感耦合等離子體質譜法等，前者的使用越來越少，后兩者已成為主流技術。張建強等［18］采用原子吸收光譜技術建立了紫皮石斛中5種重金屬元素（鉻、鎘、鉛、汞和銅）的測定方法，結果顯示，根和莖中均檢測到了鉻、汞、銅，未檢測到鎘、鉛。楊健等［19］采用電感耦合等離子體原子發射光譜技術建立了鮮地黃中砷、汞、鉛和鎘的測定方法，測定結果表明，11個不同產地的鮮地黃中鉛、砷和鎘殘留均符合國家《藥用植物及制劑外經貿綠色行業標準》，而汞殘留超標。錢正明等［20］采用微波消解-電感耦合等離子體質譜法建立了一種同時測定鮮冬蟲夏草樣品中鉛、鎘、砷、汞、銅5種重金屬殘留量的分析方法，并對15批鮮冬蟲夏草樣品進行了檢測，結果顯示，15批樣品5種重金屬殘留均符合中國、美國和歐洲的藥典標準要求。

農藥殘留也會影響鮮藥品質。盛振華等［21］采用在線凝膠色譜-氣相質譜聯用技術建立了鮮浙貝母藥材中敵敵畏、樂果、脫葉磷等17種農藥殘留的測定方法，并對市場上收集的3批鮮藥樣品進行了分析，其中二苯砜的平均含量為0.214 mg/kg，咯菌腈的平均含量為0.112 mg/kg，其余農藥均未檢出。該方法簡便、快速和靈敏，可滿足鮮貝母中多種農藥殘留的同時檢測。

5 鮮藥生物活性評價

鮮藥生物活性檢測技術是以鮮藥的生物反應活性為基礎，采用特定試驗測定鮮藥生物活性，從而對鮮藥進行質量評價［22］。錢正明等［6］以超氧化物歧化酶（SOD）活力為評價指標分析鮮冬蟲夏草及不同干燥條件下的干品，結果顯示，鮮冬蟲夏草SOD酶活力最好，凍干冬蟲夏草、陰干冬蟲夏草和烘干冬蟲夏草的SOD酶活力依次減少，其中烘干冬蟲夏草樣品的SOD酶活力僅為鮮品的1/3。相較于干燥藥材，鮮藥細胞內的生物活性分子保存較好，是鮮藥材相對干品在藥效上的優勢之一。因此，在鮮藥質量評價中引入生物活性檢測技術將有助于鮮藥質量的全面評價。

6 小結

鮮藥為中醫藥產業的重要組成部分，大量應用于疾病治療和健康養生領域。目前，鮮藥標準數量有限，難以滿足大量實際應用鮮藥品種的需求，未來需針對鮮藥的實際使用品種情況制訂相關標準，以規范鮮藥的質量，保障產業的穩步發展。現行鮮藥質量標準，部分品種存在研究不深入、檢測項目不完善的情況，如荷葉邊和鮮鐵扁擔標準只規定了藥材來源，未有任何其他檢測項目。中藥鮮品在化學成分和藥理藥性等方面與干品會有所不同，干品質量標準不一定適用于鮮藥。建議加強中藥鮮品與干品的比較研究，找出其共同點及差異點，建立鮮藥特色質量評價方法，并納入鮮藥質量評價標準。