豬隱孢子蟲、賈第蟲及畢氏腸微孢子蟲的研究進展

莫全 鄧宇

（西昌學院動物科學學院 61500）

隱孢子蟲病、賈第蟲病及微孢子病作為3 種新興傳染病，分別由隱孢子蟲 （Cryptosporidium spp.）、賈第蟲 （G.duodenalis）及微孢子蟲 （Microsporidium）3 種病原體引起，其爆發通常與飲用或食用被污染的水或者食物有關，因此被認為是水源性和食源性疾病[1-4]。隱孢子蟲、賈第蟲及微孢子蟲均為寄生性原生生物，其宿主范圍廣泛，能感染家畜、野生動物和人類，其卵囊/包囊/孢子的傳播主要通過糞-口途徑，有直接傳播（動物-動物接觸、人-動物接觸、人-人接觸）和間接傳播 （水源、食物源）兩種方式。免疫功能健全的人感染隱孢子蟲、賈第蟲及微孢子蟲后主要表現為自限性腹瀉和暫時性的腸胃炎，通常能自愈；免疫功能不全者可出現致命性的頑固性腹瀉[2-4]。人類感染隱孢子蟲后通常伴隨腹部疼痛、發燒、嘔吐、吸收不良和嚴重的持久性腹瀉。至今還未有針對隱孢子蟲病的有效疫苗[5]。賈第蟲又稱藍氏賈第蟲或賈第鞭毛蟲，動物和人感染賈第蟲后可表現為腹瀉、腹部絞痛、腹脹、體重減輕及吸收不良等癥狀。人感染賈第蟲后通常無臨床癥狀，尤其是發展中國家的人。目前發現的微孢子蟲蟲種至少有1300 種，歸入了160個屬中，Enterocytozoon、Encephalitozoon，Pleistophora、Trachipleistophora、Vittaforma、Brachiola、Nosema 和 Microsporidium 為主要感染人類的微孢子蟲屬。屬于Enterocytozoon （腸上皮細屬）的畢氏腸微孢子蟲 （E.bieneusi）是造成人微孢子蟲病的主要蟲種。家豬 （Sus scrofa domesticus）和野豬 （Sus scrofa）均屬于野豬種 （S.scrofa），其分布廣泛，易于感染寄生蟲從而造成經濟損失，同時因其較易與人類及其他動物接觸，在放養條件下容易接觸污染水源，因此對豬隱孢子蟲、賈第蟲及畢氏腸微孢子蟲感染情況進行調查非常必要，具有重要的公共衛生學意義。本文主要就豬隱孢子蟲、賈第蟲及畢氏腸微孢子蟲的研究現狀做一綜述。

1 豬隱孢子蟲、賈第蟲、微孢子蟲檢測方法

1.1 豬隱孢子蟲檢測方法

隱孢子蟲可以通過染色后鏡檢、檢測熒光抗體或其他抗原檢測方法等進行檢測。改良的抗酸染色法 （Ziehl-Neelsen staining）是最常用的染色技術。鏡檢法需要的器材簡單、成本較低，但敏感性和特異性低；熒光抗體檢測技術敏感性更高，在一些研究中，其敏感性可達97%，而抗酸染色法敏感性為75%。但熒光抗體檢測技術比抗酸染色成本高，需要熒光顯微鏡和專業人員進行操作。其他抗原檢測方法如酶聯免疫吸附測定、酶免疫檢測和免疫層析 （試紙）檢測，能減少檢測時間，診斷敏感性在70%～100%[5]。PCR 技術具有特異性，能區分隱孢子蟲蟲種，已廣泛應用于隱孢子蟲臨床診斷和環境監測等方面，SSU rRNA 基因是鑒定隱孢子蟲常用的標記基因[5]。目前，在豬隱孢子流行病學研究中，研究者們多采用染色鏡檢與PCR技術相結合的方法，而單獨采用鏡檢法或PCR 法的情況比較少。Kvác 等[6]、Langkjaer 等 [7]和 Chen 等 [8]就采用染色鏡檢與PCR 技術相結合的方法分別對捷克共和國、丹麥、中國的豬進行隱孢子蟲流行病學檢測和分子鑒定。Wang 等 [9]采取直接提取DNA 后用PCR 擴增標記基因的方法判定豬隱孢子蟲感染情況。Nguyen 等 [10]采用改良的抗酸染色法對越南740 頭豬進行隱孢子蟲檢測發現，134 頭豬感染隱孢子蟲，感染率為18.2%。Jeníková 等 [11]針對豬常感染的 C.suis 和 C.scrofarum 設計了種特異性引物 （Species-specific primers），用于試驗后鑒定到的混合感染率達到10%，而常用的屬特異性引物 （Genusspecific primers）鑒定到的混合感染率僅為0.2%，可見引物的改良提高了隱孢子蟲蟲種檢測的靈敏度和準確性。

1.2 豬賈第蟲蟲檢測方法

賈第蟲可以通過PCR 擴增標記基因、染色鏡檢包囊、檢測抗體、抗原等方法進行檢測。分子生物學為檢測賈第蟲提供了強有力的方法，并且通過分析其屬內遺傳差異，對賈第蟲分類學、群體遺傳學及賈第蟲病在人類和馴養動物的流行情況有了更深入的理解。最近的分子工具能在種/聚集體/基因型水平上鑒定賈第蟲，已經廣泛運用于賈第蟲基因型的鑒定。分子診斷工具是由靶向基因位點 （如 SSU rRNA、gdh、tpi、ef1、bg 和vsp 基因位點）、基因位點數目及后續工作 （限制性片段長度多態性分析或PCR 產物序列分析）等組成的[4]。免疫熒光分析技術檢測賈第蟲包囊、免疫熒光抗體法檢測包囊壁抗原和分子生物學的方法已經運用在豬賈第蟲感染情況的研究中[12，13]。

1.3 豬微孢子蟲檢測方法

隨著科學技術的發展，微孢子蟲的檢測技術越來越多，主要包括光學顯微鏡檢查、血清學檢查及分子生物學檢查。光學顯微鏡檢查方法需要結合特殊的染色法，但不能確定微孢子的蟲種[3]。血清學方法檢查微孢子蟲主要是通過檢測其IgG 和IgM，而宿主類型、機體的免疫狀態、感染的微孢子蟲蟲種等因素又能影響檢查結果。分子生物學方法具有特異性和敏感性等優點，已廣泛用于微孢子蟲蟲種的鑒定。由于不同分離株之間內轉錄間隔區 （ITS）的rRNA 基因具有高度的多樣性，因此，ITS 序列是目前最為認可的遺傳標記基因，已經廣泛應用于E.bieneusi 基因型的檢測和鑒定的研究[3]。研究者也普遍采用PCR 擴增ITS 基因位點來檢測豬感染畢氏腸微孢子蟲的情況[14-16]。

2 豬隱孢子蟲、賈第蟲、畢氏腸微孢子蟲的感染概況

2.1 豬隱孢子蟲感染概況

目前，已發現了31 種有效的隱孢子蟲種，超過20 種蟲種或者基因型已經在人上被發現，分別是C.hominis、C.parvum、C.meleagridis、C.felis、C.canis、C.cuniculus、C.ubiquitum、C.viatorum、C.muris、C.suis、C.fayeri、C.andersoni、C.bovis、C.scrofarum、C.tyzzeri、C.erinacei、Cryptosporidium horse 和 Skunk and Chipmunk I genotypes，其中 C.parvum 和 C.hominis 是感染人類最常見的蟲種，也是造成隱孢子蟲病爆發的主要蟲種[5]。C.suis 和C.scrofarum 又曾被稱為豬基因型I 和豬基因型II，是感染豬主要的隱孢子蟲蟲種。研究表明，豬也能感染C.muris，C.tyzzeri，C.parvum，C.felis，C.hominis，C.andersoni 和 C.meleagridis 等蟲種，而這些隱孢子蟲均曾在人上被報道。研究表明，C.suis 和C.scrofarum 在豬中的分布與年齡相關，前者常見于斷奶前仔豬，后者主要見于大豬。通過糞樣檢測、PCR 技術和血清學診斷的方法，在愛爾蘭、加拿大、美國、澳大利亞、西班牙、捷克共和國等國家已有豬感染隱孢子蟲的報道，且不同地區感染情況不同[17]。在中國，已經報道了重慶、陜西、上海、黑龍江、河南、江蘇、臺灣地區有家豬感染隱孢子蟲，感染率為 3.3%～55.8%，感染蟲種為 C.suis，C.scrofarum，C.andersoni和 C.tyzzeri[8，9，17-21]。目前關于野豬感染隱孢子蟲的報道集中在歐洲國家，如西班牙 （7.6%～16.7%）、捷克共和國 （16.5%～16.9%）、波蘭 （0%～8.5%）及斯洛伐克共和國 （5.4%），其感染率也各不相同。但僅發現3 種隱孢子蟲可感染野豬，分別是C.scrofarum、C.suis 和 C.parvum，其中 C.scrofarum 為優勢蟲種，其次是 C.suis。C.scrofarum 是人畜共患蟲種，已經在人類、家養動物、甚至是水中被檢測到。因此，豬可能是隱孢子蟲的儲存宿主，然后將其傳播給人類及其他動物[17，22，23]。

2.2 豬賈第蟲感染情況

目前，賈第蟲至少有8 個有效集聚體，集聚體A、B 為人畜共患型，具有廣泛的宿主范圍，集聚體C-H 具有宿主特異性，其中C/D 集聚體主要感染犬科動物，E 集聚體主要感染偶蹄類動物，F、G 和H 集聚體分別主要在貓科動物、嚙齒類動物及灰海豹中被發現[4]。流行病學資料表明，澳大利亞、巴西、丹麥、加拿大、英國、挪威等國家豬存在賈第蟲感染的情況，感染率為1.4%～66.4%，集聚體包括A-F。在發展中國家和發達國家，有研究報道了集聚體A、E 在家畜 （豬、牛羊等）、伴侶動物 （犬、貓、馬等）、野生動物 （大猩猩、狼、海貍等中鑒定到A 集聚體；紅疣猴、黇鹿等中鑒定到E 集聚體）中被檢測到。關于野豬感染賈第蟲的報道僅有一例。Beck等[13]運用熒光顯微技術和PCR 法鑒定出野豬感染的為集聚體A 型。我們在近期試驗發現，野豬感染了集聚體A 型和E 型，并且E 型為優勢基因型，由于E 型也是感染家豬的優勢基因型，賈第蟲可能在家豬和野豬之間發生種間傳播，但究竟是家豬還是野豬是傳染源，這個目前尚不清楚。最近有研究報道了巴西里約的一貧民窟中有15 個人感染了E 集聚體，證明了人類也可以通過動物-人傳播途徑感染賈第蟲E 集聚體[24]。綜上所述控制豬源賈第蟲病具有重要的公共衛生學意義。

2.3 豬微孢子蟲感染概況

目前畢氏腸微孢子蟲已經有超過200 多種基因型，根據系統進化分析將其分為8 個遺傳組 （group1-8）：人畜共患的group 1 和具有宿主特異性的group 2-8。在中國，一些研究報道了家豬感染畢氏腸微孢子蟲，并且鑒定出20 多種基因型，包括CS-1、CS-3、CS-4、CS-6、CS-9、CS-10、EbpA、EbpB、EbpC、EbpD、Henan-I、Henan-IV、G、D、H、O、LW1、CHN1、CHN7、CHN8、CHN9、CHN10、EBITS3、PigEBITS5、HLJ-I 至 HLJ-IV，大部分基因型都屬于 group 1[14，25-28]。在國外，美國、日本、韓國、瑞士、泰國、捷克共和國等國家也報道了家豬感染畢氏腸微孢子蟲的情況，鑒定出了D、CAF1、EbpC、O、PigEBITS7、EbpA、G、H、E1、F1、PigEBITS1 至PigEBITS8 等基因型[3]。目前在豬中鑒定到的基因型至少有60多種[29]。Slodkowicz-Kowalska 等 [30]通過變色酸 2R 和 FISH 法檢測到波蘭的一頭野豬感染畢了氏腸微孢子蟲，但未確定其基因型，這是野豬感染 E.bieneusi 的首次報道。Němejc 等 [16]對460 頭野豬進行了畢氏腸微孢子蟲分子流行病學調查發現，33頭野豬糞便呈現陽性，鑒定出了 D、EbpA、EbpC、G、Henan-I、WildBoar1 至 WildBoar6 基因型，其中 EbpA 是最常見的基因型。本實驗室對四川省部分野豬進行E.bieneusi 感染情況調查，結果發現了5 種新的基因型，（分別命名為WildBoar 7 至WildBoar 11）和 8 種已知的基因型 （EbpC、D、PigEBITS5、F、CHG19、CHC5、RWSH4 及 SC02），并且 EbpC 為優勢基因型。

目前還未有很好的針對隱孢子蟲病、賈第蟲病及微孢子蟲病的疫苗和藥物，且隱孢子蟲、賈第蟲、微孢子蟲作為重要的人獸共患機會致病性病原體，呈世界性分布，嚴重威脅人與動物的健康。家豬和野豬可能是動物和人隱孢子蟲病、賈第蟲病及微孢子蟲病甚至是水源污染的重要的傳染源。然而目前關于豬和野豬感染隱孢子蟲、賈第蟲、微孢子蟲的研究資料還不充分，人們對傳染來源及傳播途徑的理解還很有限，因此，研究者們還需要進行更多的關于動物、人、水源隱孢子蟲、賈第蟲、微孢子蟲的分子流行病學調查，來更好的闡釋其傳播途徑。